誰才是抗癌藥物的終極生產(chǎn)者？植物還是……| 微生物“智”造

作者：谷猛（中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 微生物制造工程中心）

策劃：李輝 呂雪峰

文章來源于科學(xué)大院公眾號（ID：kexuedayuan）

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紫杉醇的大名很多人都聽過，這種從紅豆杉樹中提取的天然藥物是抗癌的明星產(chǎn)品。它給許多患者帶來希望的同時，也給紅豆杉樹造成了毀滅性的打擊。

那有沒有辦法人工生產(chǎn)紫杉醇呢？這就要靠那些“小不點(diǎn)”啦！

正在化療的癌癥患者（圖片來源：veer）

風(fēng)光無限的紫杉醇

紫杉醇藥物自從1992年被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市以來，銷售額屢創(chuàng)新高，1994年銷售額就達(dá)到4億美元，2000年銷售額更是達(dá)到16億美元，創(chuàng)下單一抗癌藥銷量之最。目前，紫杉醇已成為世界銷量第一的抗腫瘤藥物，也是世界上公認(rèn)的強(qiáng)活性廣譜抗腫瘤藥物，被譽(yù)為20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成就之一（其他成就：喜樹堿、維A酸）。

紫杉醇具有什么獨(dú)特的抗癌機(jī)制，能獲得如此多的贊譽(yù)和肯定呢？這就不得不提到一位女科學(xué)家Susan Band Horwitz博士。Horwitz博士通過長期研究，最終于1979年闡明了紫杉醇獨(dú)特的抗癌作用機(jī)制。2019年，Horwitz博士也憑借這項(xiàng)研究成果榮獲素有“小諾貝爾獎”之稱的加拿大蓋爾德納國際獎。

Susan Band Horwitz博士（圖片來源：https://www.pnas.org）

紫杉醇抗癌，首先要從微管蛋白說起。

微管蛋白是細(xì)胞體內(nèi)重要的物質(zhì)，存在兩種形態(tài)——細(xì)胞正常時微管蛋白和細(xì)胞分裂時形成的微管蛋白二聚體。微管蛋白不斷發(fā)生著組裝和降解，才能讓細(xì)胞正常進(jìn)行分裂活動。

紫杉醇的作用便是促進(jìn)微管蛋白聚合形成二聚體，同時防止二聚體構(gòu)成的微管解聚。也就是說，紫杉醇會讓細(xì)胞在分裂過程中被“卡住”，細(xì)胞就會停止分裂，進(jìn)而發(fā)生凋亡。本來可以無限分裂增殖的癌細(xì)胞被按下了暫停鍵，紫杉醇的抗癌作用也就得到發(fā)揮了。但是紫杉醇不光對癌癥細(xì)胞起作用，也能對正常分裂的細(xì)胞起作用。為了降低其副作用，目前通常采用紫杉醇包埋靶向藥物載體的方式對癌癥部位進(jìn)行靶向治療，有效減少對機(jī)體其他正常分裂細(xì)胞的副作用。

對照（左）細(xì)胞正常分裂；紫杉醇（右）抑制細(xì)胞微管的解聚，阻止細(xì)胞分裂（圖片來源：參考文獻(xiàn)17）

此外，隨著對紫杉醇的不斷深入研究，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)紫杉醇不僅可以用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等癌癥疾病，還可以用于制備心臟支架的藥物涂層，來抑制血管繼續(xù)變窄等作用，同時也是研究微管的結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和功能的重要工具。

雖然紫杉醇具有如此多的優(yōu)點(diǎn)，但卻存在著一個致命的缺陷——原材料供應(yīng)。

兩難之境：紫杉醇原材料問題

紫杉醇唯一的原料來源便是數(shù)量極其稀有的紅豆杉。紅豆杉，又稱紫衫或赤柏松，最早起源于中侏羅紀(jì)，是遠(yuǎn)古第四紀(jì)冰川遺留下來的古老孑遺植物，是世界上公認(rèn)瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，數(shù)量極其稀少且生長緩慢僅在北半球存在零星分布，是我國國家一級保護(hù)植物，被稱為“植物界的大熊貓”。

紅豆杉照片（圖片來源：Wikipedia）

紅豆杉的樹皮中紫杉醇含量最高，但最高含量也才僅為0.01％—0.02％。正因如此，粗品紫杉醇的價格曾一度炒到200萬美元/公斤，面對高額收購價，利益熏心的人終于坐不住了，紛紛開始對植物界的“大熊貓”紅豆杉下手。

“匹夫無罪，懷璧其罪”，因?yàn)楹凶仙即?，在二十世紀(jì)末的幾年時間里，全球超過80%的紅豆杉被砍伐一空，中國云南滇西橫斷山區(qū)中的300多萬棵紅豆杉也不能幸免遇難，大部分被剝掉樹皮，默默死去。直到各國國家出臺法律嚴(yán)禁砍伐，這場“屠戮”風(fēng)波才慢慢停息。

從自然資源中提取藥物，造?；颊?，本是件治病救人的好事，但如何在藥物開發(fā)和保護(hù)自然資源之間尋求平衡，這是我們今天必須面對的現(xiàn)實(shí)問題。

小不點(diǎn)的大作用

面對紫杉醇原料供應(yīng)的兩難之境，各個領(lǐng)域的科學(xué)家開始進(jìn)行不同的嘗試。

首先是化學(xué)全合成和半合成策略。

化學(xué)全合成是指利用化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單的化工產(chǎn)品為起始原料經(jīng)過一系列化學(xué)合成反應(yīng)和物理處理過程制得最終產(chǎn)物。早在上個世紀(jì)七十年代初，紫杉醇便憑借復(fù)雜和新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)吸引了全球30多個頂尖化學(xué)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)參與到其化學(xué)全合成中，在之后三十年間，陸續(xù)有七個研究小組完成途徑各異的合成途徑，但合成步驟過長（最少也需要37步），不僅需要使用昂貴的化學(xué)試劑，而且反應(yīng)條件極難控制，收率也偏低（最高也才3%左右）。因此，利用化學(xué)全合成生產(chǎn)紫杉醇的想法只能作罷。

10-DAB(左)與紫杉醇（右）化學(xué)結(jié)構(gòu)對比（圖片來源：參考文獻(xiàn)2）

但與化學(xué)全合成相伴而生的半合成策略卻帶來意外的驚喜，半合成則指用具有一定基本結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物后經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)改造和物理處理過程制得最終產(chǎn)物。1981年法國Pierre Potier教授首次從英國紫杉的葉子分離得到跟紫杉醇具有相同母核結(jié)構(gòu)的化合物10-deacetyl baccatin III（10-DAB），并隨后利用其為原料成功合成紫杉醇。該方法比天然提取成本低，且對環(huán)境生態(tài)更加友好。因此利用人工培育速生紅豆杉的枝葉作為原料加上化學(xué)合成的生產(chǎn)紫杉醇途徑開始全面應(yīng)用，大大緩解了紫杉醇的藥源供應(yīng)問題。紫杉醇的價格也出現(xiàn)嚴(yán)重的“高臺跳水”，身價也由200萬美元/公斤變成現(xiàn)在2-4萬美元/公斤。

Pierre Potier教授為紫杉醇的半合成途徑做出卓越貢獻(xiàn)（圖片來源：https://www.nature.com/articles/440291a）

但是，只要利用植物來源作為前體，就不得不考慮植物生長的周期性、外界天氣及其季節(jié)等因素導(dǎo)致成本問題，這些都是制約紫杉醇的價格繼續(xù)下降的重要原因。不過隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，不起眼的“小不點(diǎn)”——微生物卻能起到重要的作用。

微生物作為藥物來源的優(yōu)點(diǎn)：

1. 微生物生長繁殖速度快：微生物生長迅速，長的最快的微生物十幾分鐘之內(nèi)便可進(jìn)行一次分裂，易于縮短生產(chǎn)周期，而且還易于培養(yǎng)。

2. 微生物遺傳操作簡單：工程師對一些明星微生物“知根知底”，用來改造他們的工具也比較完善，這些工具能夠助力工程師對微生物進(jìn)行改造，用于生產(chǎn)紫杉醇。

3. 易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)：在工業(yè)上可用發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)并生產(chǎn)紫杉醇，不受天氣等因素的影響，同時目前微生物規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)較為成熟。

微生物作為紫杉醇的藥源既然有這么多優(yōu)點(diǎn)，那現(xiàn)在發(fā)展又如何呢？

如何用微生物生產(chǎn)紫杉醇呢?

利用微生物作為藥源生產(chǎn)藥物的關(guān)鍵，在于如何從數(shù)量眾多的微生物中選擇合適的那種或那幾種微生物進(jìn)行生產(chǎn)，目前存在兩個思路：一是利用本身能產(chǎn)該化合物的微生物進(jìn)行生產(chǎn)，二來則是利用合成生物學(xué)的思路將能產(chǎn)該化合物的途徑給“挖過來”安裝在如大腸菌株等工程菌株進(jìn)行生產(chǎn)。因此，我們就這兩個途徑分別跟大家來聊聊。

1.內(nèi)生菌發(fā)酵

內(nèi)生菌是一種寄生在健康植物體內(nèi)的微生物，不會造成任何病狀，同時還能給寄主提供反抗昆蟲、草食性動物、病原體等作用。1993年美國兩位科學(xué)家Stierle教授和Strobel教授在紅豆杉的樹皮中發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)生真菌——安德氏紫杉霉(Taxomyces andreanae)，它能夠自主產(chǎn)生紫杉醇，這一研究發(fā)現(xiàn)讓正在解決紫杉醇原料來源問題的科學(xué)家大為興奮，他們開始了對內(nèi)生真菌的菌種分離和選育工作。到目前為止，已經(jīng)記錄的超過40個真菌屬的近200個內(nèi)生菌能夠生成紫杉醇，其寄主范圍也不僅限于紅豆杉屬植物，還包含禿柏、Wollemi松及Torreya grandifolia等非紅豆杉屬植物。

不同種植材料生長的內(nèi)生真菌菌落。A樹皮碎片，B種子，C樹枝（圖片來源：參考文獻(xiàn)13）

雖然內(nèi)生真菌介導(dǎo)的發(fā)酵過程是一種很有前途的生產(chǎn)紫杉醇的替代方法，但產(chǎn)量不穩(wěn)定、產(chǎn)量低是開發(fā)內(nèi)生菌生產(chǎn)紫杉醇的巨大挑戰(zhàn)。目前報道的產(chǎn)率是從0.001 ng/mL到800 ng/mL不等，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到用于生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，同時還有大部分內(nèi)生菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法重復(fù)或者在傳代過程中失去生產(chǎn)紫杉醇的特性。這些現(xiàn)象也讓不少研究學(xué)者質(zhì)疑，這些內(nèi)生菌獨(dú)立于宿主植物外是否還存在合成紫杉醇的能力。雖然也有研究人員從共生、外界環(huán)境刺激角度展開研究，來解釋內(nèi)生菌在傳代過程中出現(xiàn)的產(chǎn)量下降的問題。但因缺少對內(nèi)生菌體內(nèi)具體合成途徑的信息，也很難深入研究，這一缺點(diǎn)也是制約內(nèi)生真菌發(fā)酵的問題所在。

2.合成生物學(xué)

既然直接利用內(nèi)生菌進(jìn)行生產(chǎn)難度比較大，那如果改變策略，將植物體內(nèi)產(chǎn)紫杉醇途徑的相關(guān)基因移植到適合生產(chǎn)的工程菌株上是否可行呢？

2001年，Huang QL等人將紫杉醇前體的紫杉醇二烯（taxadiene）合成途徑的相關(guān)基因?qū)氲酱竽c桿菌系統(tǒng)中，相關(guān)基因成功在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)，其產(chǎn)量為1.3 mg/L的紫杉醇二烯。之后，酵母系統(tǒng)也成功表達(dá)并能夠生產(chǎn)紫杉醇二烯，到目前為止，最高的異源紫杉二烯產(chǎn)量為大腸桿菌的1.02g/L和釀酒酵母72.8 mg/L。這些結(jié)果都表明將紫杉醇合成途徑導(dǎo)入到大腸桿菌、酵母等工程菌株中是具有一定可行性的策略，且有很大發(fā)展?jié)摿?，這種相關(guān)基因異源表達(dá)的方法也是目前主流研究紫杉醇生物合成的方法。

大腸桿菌多元模塊化代謝途徑（圖片來源：參考文獻(xiàn)16）

到目前為止，雖然異源表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建已經(jīng)取得了驚人的成績，但距離真正微生物生產(chǎn)紫杉醇甚至10-DAB都還有一定的距離，存在一些問題如植物體內(nèi)紫杉醇是如何生物合成，每一步是由哪些基因表達(dá)的蛋白起的作用，如此復(fù)雜且漫長的紫杉醇生物合成途徑又要如何導(dǎo)入到異源系統(tǒng)中等等有待解決。相信隨著合成生物學(xué)，基因編輯，人工底盤細(xì)胞的開發(fā)等技術(shù)的不斷進(jìn)步，在不久將來定能夠?qū)崿F(xiàn)利用微生物產(chǎn)紫杉醇的宏愿。

展望

紫杉醇從發(fā)現(xiàn)、生產(chǎn)和應(yīng)用經(jīng)歷了幾十年的研究，在無數(shù)科學(xué)家的努力下，曾經(jīng)只能通過提取珍貴紅豆杉樹皮才能獲取的紫杉醇，到現(xiàn)在只需收獲枝葉便可以化學(xué)合成，未來我們也許利用異源表達(dá)的策略和微生物發(fā)酵技術(shù)，就能源源不斷地生產(chǎn)紫杉醇，紫杉醇藥物價格也不再會成為患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

前有青蒿酸生物合成的工業(yè)化應(yīng)用作為先驅(qū)，后有不斷探索的紫杉醇微生物合成，“小不點(diǎn)”微生物已經(jīng)開始在植物源天然產(chǎn)物的生物合成領(lǐng)域嶄露頭角了。相信在不久的將來，利用微生物獲取更多對人類有益的植物源天然產(chǎn)物將會越來越多的成為可供選擇的方案。

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