這條捷徑，就是“草根”微生物的巨星之路丨微生物“智”造

作者：李輝、呂雪峰（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 微生物制造工程中心）

文章來源于科學(xué)大院公眾號(hào)（ID：kexuedayuan）

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人類世界的每個(gè)行業(yè)里都存在“巨星”，微生物的世界里也不例外。但如同很少人一開始就具備巨星的特質(zhì)一樣，微生物世界里也少有一開始就能滿足工程師所有期待的微生物，更多的是有一技之長(zhǎng)，卻并不全能的“草根選手”。這樣的“草根”微生物，有快速成為“巨星”的可能嗎？

工業(yè)微生物界給出的答案是：yes！

慧眼識(shí)珠的工程師和快速補(bǔ)齊“草根”微生物短板的技術(shù)是關(guān)鍵。今天，大院要介紹的就是一種能夠讓“草根”微生物快速進(jìn)階的技術(shù)——無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（Cell-free gene expression system）。

“草根”成名的必經(jīng)之路

在了解具體的技術(shù)之前，我們需要先來回答三個(gè)問題。

“明星”微生物是什么樣？

作為工業(yè)微生物界的明星，必須擁有出色的三個(gè)核心指標(biāo)：產(chǎn)物的滴度（Titer）、產(chǎn)率（Yield）和生產(chǎn)效率（Productivity），這三個(gè)參數(shù)的詳解見上一期生物工程師的致富之路：微生物細(xì)胞工廠打造指南。其次它的食譜應(yīng)盡可能地廣泛，在惡劣環(huán)境中的耐受性也要出眾。而為了達(dá)成這些指標(biāo)，要求工程師擁有較為完善的工具包，以便對(duì)這種微生物進(jìn)行改造。

“明星”微生物：大腸桿菌（左）和釀酒酵母（右）

（左圖來源：veer；右圖來源：維基百科）

如何才能獲得工程師的青睞？

各方面都平庸的“草根”微生物是不會(huì)有任何機(jī)會(huì)的。能獲得青睞的選手必須是可塑之材，至少在與工業(yè)應(yīng)用相關(guān)的性狀方面它要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于一般的微生物。比如，對(duì)于一個(gè)生產(chǎn)乙醇的微生物細(xì)胞工廠來說，能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖（底物范圍廣）或者能在高濃度的乙醇中活得很滋潤(rùn)（產(chǎn)物耐受性好）都是很加分的性狀。

“草根”變“巨星”需要逾越哪些鴻溝？

一般而言，在一個(gè)微生物成為高效生產(chǎn)化學(xué)品的細(xì)胞工廠之前都需要被工程師進(jìn)行大量的改造，直到找出生產(chǎn)化學(xué)品的最優(yōu)解。對(duì)于“明星”微生物來說，工程師對(duì)它們的改造手段比較成熟，在它們中進(jìn)行大量試錯(cuò)也較為方便。但是對(duì)于“草根”微生物而言，專門為它們量身定做的改造技術(shù)較為欠缺，改造起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而進(jìn)行大量試錯(cuò)對(duì)工程師來說更是雪上加霜。因此，對(duì)“草根”微生物改造能力的不成熟是制約它們快速崛起的一個(gè)主要問題。

解決這個(gè)問題通常有兩種策略：第一種策略是從頭開始逐步去開發(fā)和完善改造“草根”微生物所需的工具包，但代價(jià)是漫長(zhǎng)的時(shí)間。第二種策略則是嘗試規(guī)避試錯(cuò)的障礙，直接為微生物的改造提供一個(gè)理想的改造方案，這樣即使改造起來不方便，但由于改造的地方不多，時(shí)間成本也在可接受的范圍之內(nèi)。

第二種“造星”策略成功實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵在于必須要在較短的時(shí)間內(nèi)提供一個(gè)理想的改造方案，而無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)正是能實(shí)現(xiàn)這種可能性的一種技術(shù)。

巨星修煉場(chǎng)：無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)

理想的方案是什么呢？具體而言，是微生物細(xì)胞內(nèi)一條將原料高效轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化合物的代謝途徑。代謝途徑的高效體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先，功能上選出來的酶要能把原料逐步轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化合物。其次，不同酶之間的相對(duì)量要保持協(xié)調(diào)，任何一個(gè)酶的效率都不能掉鏈子。

無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)是指能夠?qū)NA轉(zhuǎn)化為有功能的RNA或者蛋白質(zhì)的任何方法，不需要使用完整有生命的細(xì)胞就能激活復(fù)雜的生物學(xué)過程。簡(jiǎn)單來講，無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)就是把細(xì)胞內(nèi)的一部分功能在體外進(jìn)行重現(xiàn)。

那它究竟是如何在較短的時(shí)間內(nèi)為工程師提供一個(gè)理想的改造方案？這里有一個(gè)很貼切的例子。

丁醇是工業(yè)上一種重要的溶劑和燃料，其全球市場(chǎng)高達(dá)50億美元/每年。而有一種產(chǎn)乙酸的梭菌（Clostridium autoethanogenum : C.autoethanogenum，下文所提的梭菌均特指這一種），它的底物范圍很廣，既能利用復(fù)雜的糖類（比如纖維素）也能利用一些簡(jiǎn)單的化合物（比如CO2/H2和CO），工業(yè)性狀良好，能在商業(yè)化的規(guī)模中生產(chǎn)乙醇。但它不能產(chǎn)丁醇，遺傳改造工具也不夠成熟。

美國(guó)西北大學(xué)的生物工程師們希望將這種“草根”微生物打造成一個(gè)能夠生產(chǎn)丁醇的微生物細(xì)胞工廠。要想讓梭菌產(chǎn)丁醇，需要在它體內(nèi)搭建一個(gè)新的代謝途徑，即從已有代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A到丁醇的代謝途徑，這個(gè)途徑需要六步反應(yīng)，由5種不同功能的酶來實(shí)現(xiàn)。

自然界中能完成同一個(gè)反應(yīng)的酶往往有很多種，但具體哪個(gè)最好只有試了才知道。如果前四步每個(gè)酶都選擇6個(gè)同源的蛋白，每個(gè)酶再設(shè)置3個(gè)不同的濃度梯度，那么最終的組合方式將有314928種可能。

從乙酰輔酶A到丁醇的代謝途徑以及催化相應(yīng)反應(yīng)的酶（Ashty S. Karim et al., 2020）

在梭菌中組裝一個(gè)代謝途徑一般需要數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間，而嘗試30萬種可能的途徑對(duì)工程師來說明顯超綱了。為了破解這道超綱的問題，他們針對(duì)梭菌開發(fā)了一種基于無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，一個(gè)能快速找到理想改造方案的技術(shù)平臺(tái)：體外原型化和快速優(yōu)化生物合成酶的平臺(tái)（iPROBE: In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes ）。

利用這個(gè)平臺(tái)來組裝同樣的代謝途徑有兩種策略，而它們都能把組裝時(shí)間縮短到以天計(jì)算。

第一種策略是分別將每種候選的酶在大腸桿菌中過量生產(chǎn)，確保大腸桿菌中候選酶的量很高，再將細(xì)胞裂解，然后直接將不同的裂解液進(jìn)行混合，混合的裂解液中就包含了在邏輯上組裝好的途徑，同時(shí)可以通過裂解液的添加量來控制不同酶之間的比值。之后再將底物添加到混合的裂解液中，最終通過分析儀器來檢測(cè)是否含有目標(biāo)產(chǎn)物及其含量的高低。

第二種策略和第一種策略的不同之處在于，在候選酶的生產(chǎn)過程中它是利用連有候選酶編碼基因的質(zhì)粒加上細(xì)胞裂解液，裂解液中所含有的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器可以將質(zhì)粒中的候選基因轉(zhuǎn)錄翻譯成候選的酶，產(chǎn)生酶量的多少可以通過質(zhì)粒的添加量來控制。代謝途徑的組裝和產(chǎn)物后續(xù)的檢測(cè)兩種策略是一致的。

利用cell-free系統(tǒng)同時(shí)對(duì)多種組合的途徑進(jìn)行測(cè)試(Ashty S. Karim et al., 2020)

降低途徑的組裝時(shí)間是無細(xì)胞系統(tǒng)最為突出的優(yōu)點(diǎn)之一。另外，使用細(xì)胞裂解液來組裝代謝途徑，其中涉及的操作以及對(duì)反應(yīng)體系的檢測(cè)都能讓相應(yīng)的機(jī)器去做，大大降低了人力投入，讓生物工程師擁有了對(duì)大量不同組合代謝途徑進(jìn)行分析比較的可能性。

生物工程師最終要做的就是選擇在體外表現(xiàn)最好的代謝途徑，把編碼相應(yīng)酶的基因放到“草根”微生物的基因組上，通過使用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子來控制它們?cè)诩?xì)胞中存在的量，以此來復(fù)制在體外找到的最佳改造方案。在上述案例中，當(dāng)生物工程師把找到的最優(yōu)解應(yīng)用到梭菌后，它產(chǎn)丁醇的滴度變成了22±0.1mM，而之前所報(bào)道的在梭菌中產(chǎn)丁醇的滴度最高只有2mM左右，丁醇的滴度整整提高了10倍之多。

西北大學(xué)的生物工程師們開發(fā)出這個(gè)基于無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)的平臺(tái)后，他們還嘗試?yán)盟业剿缶a(chǎn)3-羥基丁酸（3-HB）的最佳改造方案（3-HB是一種高值的專用化學(xué)品）。即使梭菌原本并不能產(chǎn)3-HB,但當(dāng)他們將找到最佳改造策略并應(yīng)用到梭菌中后，3-HB微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)3-HB的滴度能夠達(dá)到15g/L，生產(chǎn)效率也能>1.5g L-1h-1 。

這些數(shù)據(jù)不僅在梭菌中創(chuàng)了記錄，也破了之前由工業(yè)微生物界的“明星”大腸桿菌和釀酒酵母所創(chuàng)造的記錄，梭菌細(xì)胞工廠也實(shí)現(xiàn)了華麗的轉(zhuǎn)身，成為名副其實(shí)的“巨星”。

不會(huì)偷懶的生物工程師不是好的工程師

在尋找梭菌產(chǎn)丁醇的最佳改造方案時(shí)，即使在有限的條件之內(nèi)，代謝途徑的種類也已達(dá)到30多萬種。盡管無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為海量的途徑分析提供了可能性，但是工程師們并沒有逐一驗(yàn)證這30多萬種途徑的差別，畢竟不會(huì)偷懶的生物工程師不是好的工程師。

但他們也的確對(duì)30多萬種可能的途徑都做了評(píng)估，只不過直接通過實(shí)驗(yàn)評(píng)估的只有120種，其余組合的好壞都是通過一個(gè)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法來進(jìn)行預(yù)測(cè)的。簡(jiǎn)單理解，這個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)算法是指工程師們先設(shè)定了一個(gè)值TREE，這個(gè)值的大小同時(shí)取決于產(chǎn)物滴度、生成速率和酶表達(dá)情況，這幾項(xiàng)參數(shù)不同，得到的值就不一樣，這幾個(gè)參數(shù)表現(xiàn)得越好，TREE值就越高。

TREE = 滴度（Titer） × 產(chǎn)物生成速率（Rate）× 酶的表達(dá)水平（Enzyme expression）

拿實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)訓(xùn)練算法的過程就是用這120組實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果不斷校正所提出的深度模型的參數(shù)，而當(dāng)挑選一些算法預(yù)測(cè)出來的途徑在宿主中進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，結(jié)果表明深度學(xué)習(xí)算法對(duì)途徑好壞的判斷是可信的。（有關(guān)深度學(xué)習(xí)的具體內(nèi)容將在本專輯的后續(xù)文章中詳細(xì)介紹）

AI也可以是“老師傅”(來源于Tetris)

“名利場(chǎng)”之外的生命起源

在生物工程師眼里，一種技術(shù)的關(guān)注點(diǎn)在于如何把它的優(yōu)點(diǎn)最大化，以便為人類社會(huì)創(chuàng)造更大的財(cái)富和好處。但無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的強(qiáng)大之處卻不局限于工業(yè)微生物領(lǐng)域，它在理解什么是生命以及在尋找生命起源方面也擁有重要的意義。

著名的物理學(xué)家理查德·費(fèi)曼講過一句話“what I cannot creat, I do not understand”（我不能創(chuàng)造的即是我還不夠理解的）。按照這個(gè)邏輯，對(duì)生命足夠理解的一個(gè)標(biāo)志是能夠創(chuàng)造出來一個(gè)生命。

無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)，講求的是在體外不依賴完整的細(xì)胞去激活復(fù)雜的生物學(xué)過程，這個(gè)過程本質(zhì)上是尋找更加精簡(jiǎn)和原始的生命形式。當(dāng)科學(xué)家在體外用很明確的組分去組裝一個(gè)細(xì)胞時(shí)，在成功讓其顯示出主要的生物學(xué)功能的前提下，所使用的組分越少，這些組分就越可能是原始生命形式的組成部分。

噬菌體渲染圖（來源：Pinterest）

目前，利用無細(xì)胞系統(tǒng)組裝細(xì)胞，科學(xué)家也取得了一些進(jìn)展，已經(jīng)可以利用無細(xì)胞系統(tǒng)組裝較為簡(jiǎn)單的病毒。例如，早在2012年科學(xué)家就已經(jīng)在體外成功將噬菌體T7 和ФX174組裝成了具有自我復(fù)制的能力的病毒。另外在2018年，對(duì)于一個(gè)基因組更大的T4噬菌體，科學(xué)家也能利用無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)在試管中成功組裝出具有感染特性的病毒例子。

未來，無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)的潛力值得期待。

你對(duì)未來無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)有哪些想象？歡迎讀者朋友們?cè)谠u(píng)論區(qū)留下你對(duì)于無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的期待和疑問。

參考文獻(xiàn)：

[1] Karim A S, Dudley Q M, Juminaga A, et al. In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes for cell design[J]. Nature Chemical Biology, 2020, 16(8): 912-919.

[2] Silverman A D, Karim A S, Jewett M C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications[J]. Nature Reviews Genetics, 2019: 1-20.