登上Science專(zhuān)刊的CRISPR技術(shù)究竟是啥？

作者：李輝（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所）

文章來(lái)源于科學(xué)大院公眾號(hào)（ID：kexuedayuan）

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2018年8月31日，著名的學(xué)術(shù)期刊Science推出了“技術(shù)轉(zhuǎn)化生物學(xué)專(zhuān)刊”，介紹了幾種革命性的生物技術(shù)，其中一種就是基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)。

（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

CRISPR技術(shù)的來(lái)頭可不簡(jiǎn)單，今年上半年，36歲的華人學(xué)者張鋒教授當(dāng)選美國(guó)文理科學(xué)院和美國(guó)科學(xué)院院士。他的主要貢獻(xiàn)之一就是將一種免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas開(kāi)發(fā)成基因編輯工具，而之前CRISPR技術(shù)也曾分別在2013年和2015年入選SCIENCE雜志評(píng)選的年度十大科技進(jìn)展。 今天大院er就讓你迅速看懂傳說(shuō)中的CRISPR技術(shù)！

CRISPR-Cas系統(tǒng)是何方神圣

它是在細(xì)菌和古菌中廣泛存在的一種獲得性免疫系統(tǒng)，被細(xì)菌和古菌當(dāng)作抵抗病毒和外源質(zhì)粒的殺手锏之一。

它由兩部分結(jié)構(gòu)組成，第一部分是CRISPR位點(diǎn)，CRISPR位點(diǎn)中存貯著宿主曾經(jīng)消滅過(guò)的病毒或者外源質(zhì)粒的特征序列，第二部分是表達(dá)CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR相關(guān)的英文縮寫(xiě)為Cas）的基因，CRISPR相關(guān)蛋白就是CRISPR-Cas系統(tǒng)的“殺器”，一般具有核酸酶活性，能夠降解DNA。

CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)抗并消滅病毒和外源質(zhì)粒的過(guò)程可以分成三個(gè)階段，分別是試探（外源DNA的獲?。?、破招（CRISPR RNA的加工）和制勝（gRNA介導(dǎo)的降解）。

試探：在這個(gè)階段，CRISPR-Cas系統(tǒng)從初次入侵的病毒和質(zhì)粒中選取一段特異的DNA序列（spacer）插入到自身的CRISPR位點(diǎn)，算是掌握了侵入病毒和外源質(zhì)粒的特點(diǎn)，擁有了對(duì)抗他們的能力。

破招：第二個(gè)階段發(fā)生在同樣的病毒和外源質(zhì)粒再次侵入時(shí)，這時(shí)含有前一階段所獲取的spacer的CRISPR位點(diǎn)被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)一步被加工成成熟的gRNA（指導(dǎo)RNA），這些gRNA的產(chǎn)生是能夠最終消滅掉入侵的病毒或外源質(zhì)粒的關(guān)鍵，它們可以指導(dǎo)Cas蛋白靶向到相應(yīng)的病毒或質(zhì)粒。

制勝：這個(gè)階段，Cas蛋白開(kāi)始起作用，它會(huì)利用它的核酸酶活性在gRNA 介導(dǎo)Cas蛋白靶向到目的病毒或質(zhì)粒后，把病毒和質(zhì)粒進(jìn)行降解，降解完成后， CRISPR-Cas系統(tǒng)在和病毒及外源質(zhì)粒的較量中就取得了勝利。

CRISPR-Cas9是CRISPR-Cas系統(tǒng)中的一種，目前基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)是同類(lèi)型技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一種。如果要把CRISPR-Cas9開(kāi)發(fā)成基因編輯工具，我們需要設(shè)計(jì)能夠介導(dǎo)Cas9蛋白靶向到目標(biāo)DNA的gRNA ，此外還需要提供和被編輯位點(diǎn)兩端序列一致，中間含有序列被修改過(guò)的供體DNA，這樣以來(lái)在Cas9蛋白將目標(biāo)DNA切割后，供體DNA便可以和目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生重組，從而對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)完成編輯。

CRISPR技術(shù) 強(qiáng)在哪里？

和傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR具有諸多的優(yōu)勢(shì)。

CRISPR基因編輯技術(shù)大大縮短了對(duì)目的基因編輯的時(shí)間。在CRISPR基因編輯發(fā)明之前，要拿到一個(gè)滿(mǎn)足需求的轉(zhuǎn)基因小鼠需要一個(gè)博士后一年的時(shí)間，而使用這項(xiàng)技術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)化的流程下需要的時(shí)間可以減少到一個(gè)月。

CRISPR基因編輯技術(shù)同時(shí)也大大降低了基因編輯的成本。之前，利用基于鋅指酶的基因編輯技術(shù)來(lái)編輯人體內(nèi)一個(gè)編碼網(wǎng)格蛋白的基因時(shí)，每個(gè)能夠靶向特定序列的鋅指酶需要花費(fèi)25000美元，而利用CRISRP基因編輯技術(shù)，相應(yīng)的序列和酶只需要數(shù)十美元。

CRISPR的高效率使得對(duì)多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行編輯的可能性大大增加。利用傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)一般只能對(duì)單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行編輯，而目前利用基于CRISPR-Cas9的基因編輯在真核生物中最多可以對(duì)7個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行編輯，而另外一種類(lèi)型的CRISRP系統(tǒng)CRISPR-Cpf1，相應(yīng)的位點(diǎn)是4個(gè)。

CRISPR對(duì)目的位點(diǎn)強(qiáng)大的切割能力為它贏得了“基因魔剪”的美譽(yù)，而如果把Cas9蛋白的或者經(jīng)過(guò)改造后的Cas9蛋白和其它具有其它功能的蛋白聯(lián)用，CRISPR所能實(shí)現(xiàn)的功能就更多了，包括外源基因的敲入、內(nèi)源基因的敲除、敲降、對(duì)基因組DNA進(jìn)行表觀修飾和對(duì)單堿基進(jìn)行編輯等等，所以用“遺傳軍刀”去類(lèi)比它可能更加合適。

適用范圍廣也是這個(gè)技術(shù)一個(gè)非常突出的特點(diǎn)，自2012年CRISPR被證明能改造成基因編輯工具之后， 2013年MIT的張鋒教授和哈佛大學(xué)的George Church教授迅速將其用于人體細(xì)胞的編輯。隨后，CRISPR基因編輯技術(shù)也被成功的證明可以用于小鼠、斑馬魚(yú)、大鼠、果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)、擬南芥、粗糙脈胞菌、食蟹猴、兔子、豬、山羊和人等物種的基因組編輯。

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CRISPR應(yīng)用之一：消滅瘧疾

瘧疾每年造成超過(guò)50萬(wàn)人死亡，其病原體由蚊子攜帶。如果能夠降低蚊子的生殖能力，也就能夠消滅瘧疾了。在這個(gè)過(guò)程中CRISPR-Cas9系統(tǒng)也可以大顯身手。

基因驅(qū)動(dòng)技術(shù)是一種能夠?qū)⑻囟ㄐ誀钤谝粋€(gè)種群中快速傳播的技術(shù)，這個(gè)功能的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于一種“自私”的基因，這類(lèi)基因的產(chǎn)物一般是位點(diǎn)特異性的核酸內(nèi)切酶，能夠切割同源染色體上與其位置相同的序列，之后以自身為模板，對(duì)被切割的序列進(jìn)行修復(fù)，使得同源染色體上相應(yīng)的序列和自己相同，從而增加了自身序列被傳遞到子代的概率。如果把相應(yīng)的基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)放置到能夠?qū)е挛米哟菩圆挥幕蛑畠?nèi)，那么雌性不育這一性狀就會(huì)在種群中快速傳播，最終子代蚊子形成的種群中的性別會(huì)失衡，蚊子數(shù)量會(huì)下降，也就間接地達(dá)到了消滅瘧疾的效果。

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CRISPR-Cas9對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)準(zhǔn)確、高效地切割能力以及CRISPR-Cas9可以被改造成“自私”的基因這兩個(gè)特點(diǎn)使得消滅蚊子成為可能。由CRISPR-Cas9衍生的基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)由兩個(gè)部分組成，一是含有能夠靶向同源染色體上和基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)處于相同位置的gRNA，二是Cas9蛋白的編碼基因。擁有了gRNA和Cas9蛋白，可以在同源染色體上相應(yīng)的位置進(jìn)行切割，染色體被切割后有兩種結(jié)果，一是如上所述以含有基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的染色體為模板進(jìn)行重組，我們最終得到雌性不育的蚊子，另一種未能發(fā)生基因重組的蚊子則會(huì)直接死掉。這樣以來(lái)，雌性不育的性狀就在種群中傳播開(kāi)來(lái)了。

農(nóng)業(yè)、生態(tài)、醫(yī)學(xué)……CRISPR都能干！

微生物的一些代謝物可以被應(yīng)用于能源、化工和健康等行業(yè)，比如乙醇可以作為燃料，乙烯可以作為合成纖維或橡膠的原料，甘油葡萄糖苷可以作為化妝品的添加劑，因此微生物相當(dāng)于一座細(xì)胞工廠(chǎng)！盡管已經(jīng)有可以對(duì)微生物基因組進(jìn)行編輯的工具，但是CRISPR的出現(xiàn)可以讓人們更方便地改造微生物。

CRISPR基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物的改良方面有廣泛的應(yīng)用空間，目前全球最大的種子和農(nóng)藥公司杜邦公司已經(jīng)開(kāi)始利用CRISPR基因編輯來(lái)對(duì)玉米和大豆進(jìn)行改良，改良的性狀包括耐旱，提高種子的含油量以及耐除草劑等。

再生已滅絕物種是否有意義雖然存在爭(zhēng)議，但是也有科學(xué)家正在繼續(xù)研究，在2012年哈佛大學(xué)一個(gè)由George Church教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)就宣稱(chēng)要通過(guò)克隆和基因編輯技術(shù)來(lái)復(fù)活猛犸，他們所用到的基因編輯技術(shù)就是CRISPR技術(shù)。

在醫(yī)學(xué)上， CIRSPR基因編輯技術(shù)的應(yīng)用也令人振奮。源于CRISPR基因編輯的單堿基編輯技術(shù)可能治愈上萬(wàn)種由單堿基突變引起的遺傳疾病。另外，根據(jù)最近在Nature Communication發(fā)表的一項(xiàng)研究，科學(xué)家門(mén)已經(jīng)可以利用基于CRISPR的CRISPR激活（CRISPR activation）技術(shù)成功的將人類(lèi)的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成了誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞。

一個(gè)視頻，了解“上帝的剪刀”

當(dāng)然，它也是一把雙刃劍

不過(guò)，就像很多高新技術(shù)一樣，CRISPR在應(yīng)用上也存在隱患，需要在使用中進(jìn)行監(jiān)管。

從技術(shù)層面上來(lái)看，是否存在脫靶效應(yīng)一直存在著爭(zhēng)議，也就是說(shuō)在編輯目的基因時(shí)可能會(huì)對(duì)其它不期望編輯的位點(diǎn)也進(jìn)行編輯。最近發(fā)表在《Nature biotechnology》上的一項(xiàng)研究報(bào)告說(shuō)，利用CRISPR編輯老鼠胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和人類(lèi)分化的細(xì)胞系時(shí)靶標(biāo)位點(diǎn)也存在明顯的突變，包括大片段的刪除以及復(fù)雜的基因組重組，而這些突變可能致病。

另外，發(fā)表在《Nature medicine》上的一項(xiàng)研究聲稱(chēng)，利用CRISPR對(duì)人類(lèi)多能干細(xì)胞進(jìn)行編輯時(shí)，發(fā)現(xiàn)CRISPR引起的雙鏈斷裂能夠引起p53介導(dǎo)的DNA損傷響應(yīng)，而基因編輯的效率與損傷響應(yīng)是相沖突的，要想提高編輯的效率需要抑制p53介導(dǎo)的損傷響應(yīng)，但它被抑制后會(huì)增加CRISPR脫靶的概率以及罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

從社會(huì)規(guī)范的角度上看，目前已經(jīng)有不少的黑客在網(wǎng)絡(luò)上直播利用CRISPR對(duì)自己進(jìn)行基因編輯，這種做法會(huì)對(duì)公眾產(chǎn)生誤導(dǎo)，缺乏足夠相關(guān)知識(shí)的人員盲目效仿可能會(huì)對(duì)安全造成傷害。

少數(shù)人利用CRISPR對(duì)自己進(jìn)行基因編輯（切勿效仿！ 圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

另外從國(guó)家安全的角度上來(lái)看，各國(guó)政府也在關(guān)注這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，由于CRISPR基因編輯的低成本以及操作簡(jiǎn)單，2016年美國(guó)一個(gè)國(guó)立智庫(kù)在向美國(guó)參議院提交的一份報(bào)告中甚至建議將CRISPR基因編輯技術(shù)和朝鮮核試及敘利亞化武一同列到大規(guī)模殺傷性武器的名單中。

結(jié)語(yǔ)

CRISPR-Cas系統(tǒng)的多樣性是其宿主和病毒及外源質(zhì)粒長(zhǎng)期角力的必然的結(jié)果。截至目前，發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)多達(dá)6類(lèi)，19種亞型。這些不同類(lèi)型的免疫系統(tǒng)每次“轉(zhuǎn)身”所衍生出的新技術(shù)都有巨大的潛力。在未來(lái)，除了充分利用已經(jīng)開(kāi)發(fā)的技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新型CRISPR-Cas系統(tǒng)、將CRISPR-Cas系統(tǒng)改造成更多的技術(shù)以及如何對(duì)其進(jìn)行監(jiān)管和引導(dǎo)都是人們應(yīng)該努力的方向。

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