RNA

基本結(jié)構(gòu)

RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，但是在葉綠體、線粒體、細(xì)胞核、中心體中也存在少量的RNA。

1965年R.W.霍利等測定了第 1個核酸──酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的一級結(jié)構(gòu)即核苷酸的排列順序。此后,RNA一級結(jié)構(gòu)的測定有了迅速的發(fā)展。到1983年,不同來源和接受不同氨基酸的tRNA已經(jīng)弄清楚一級結(jié)構(gòu)的超過280種,5S RNA 175種,5.8S RNA也有幾十種,以及許多16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和26S rRNA。在mRNA中，如哺乳類珠蛋白mRNA、雞卵清蛋白mRNA和許多蛋白質(zhì)激素和酶的mRNA等也弄清楚了。此外還測定了一些小分子RNA如sn RNA和病毒感染后產(chǎn)生的RNA的核苷酸排列順序。類病毒RNA也有5種已知其一級結(jié)構(gòu)，都是環(huán)狀單鏈。MJS2RNA、煙草花葉病毒 RNA、小兒麻痹癥病毒RNA是已知結(jié)構(gòu)中比較大的RNA。

除一級結(jié)構(gòu)外，RNA分子中還有以氫鍵聯(lián)接堿基（A對U；G對C）形成的二級結(jié)構(gòu)。RNA的三級結(jié)構(gòu)，其中研究得最清楚的是tRNA,1974年用X射線衍射研究酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的晶體,已確定它的立體結(jié)構(gòu)呈倒L形（見轉(zhuǎn)移核糖核酸）。

RNA 一級結(jié)構(gòu)的測定常利用一些具有堿基專一性的工具酶，將RNA降解成寡核苷酸,然后根據(jù)兩種(或更多)不同工具酶交叉分解的結(jié)果，測出重疊部分,來決定RNA的一級結(jié)構(gòu)。舉例如下：

AGUCGGUAG

牛胰核糖核酸酶 高峰淀粉酶核糖核酸酶T1

(RNase A) (RNase T1)

AGU+C+GGU+AG AG+UCG+G+UAG

牛胰核糖核酸酶是一個內(nèi)切核酸酶，專一地切在嘧啶核苷酸的3′-磷酸和其相鄰核苷酸的5′-羥基之間，所以用它來分解上述AGUCGGUAG9核苷酸,得到AGU、C、GGU和AG4個產(chǎn)物。而核糖核酸酶 T1是一個專一地切在鳥苷酸的3′-磷酸和其相鄰核苷酸的5′-羥基之間的內(nèi)切核酸酶，它作用于上述9核苷酸,則得到AG、UCG、G和UAG4個產(chǎn)物。根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì),就可以排列出9核苷酸的一級結(jié)構(gòu)。

除上述兩種核糖核酸酶外，還有黑粉菌核糖核酸酶(RNase U2)，專一地切在腺苷酸和鳥苷酸處，和高峰淀粉酶核糖核酸酶T1聯(lián)合使用,可以測定腺苷酸在RNA中的位置。多頭絨孢菌核糖核酸酶(RNase Phy)除了CpN以外的二核苷酸都能較快地水解，因此和牛胰核糖核酸酶合用可以區(qū)別Cp和Up在RNA中的位置。

生物功能和種類 20世紀(jì)40年代，人們從細(xì)胞化學(xué)和紫外光細(xì)胞光譜法觀察到凡是 RNA含量豐富的組織中蛋白質(zhì)的含量也較多,就推測RNA和蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)。RNA 參與蛋白質(zhì)生物合成過程的有 3類：轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖體核糖核酸(rRNA)。

詳細(xì)功能

不同的RNA 有著不同的功能 ，其中rRNA是核糖體的組成成分，由細(xì)胞核中的核仁合成，而mRNA tRNA 在蛋白質(zhì)合成的不同階段分別執(zhí)行著不同功能。

mRNA是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補(bǔ)配對原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá)，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁

tRNA的功能是攜帶符合要求的氨基酸，以連接成肽鏈，再經(jīng)過加工形成蛋白質(zhì)

具體請參閱高中生物第二冊，遺傳部分

RNA指 ribonucleic acid 核糖核酸

核糖核苷酸聚合而成的沒有分支的長鏈。分子量比DNA小，但在大多數(shù)細(xì)胞中比DNA豐富。RNA主要有3類，即信使RNA（mRNA），核糖體RNA（rRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）。這3類RNA分子都是單鏈，但具有不同的分子量、結(jié)構(gòu)和功能。

在RNA病毒中，RNA是遺傳物質(zhì)，植物病毒總是含RNA。近些年在植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些比病毒還小得多的浸染性致病因子，叫做類病毒。類病毒是不含蛋白質(zhì)的閉環(huán)單鏈RNA分子，此外，真核細(xì)胞中還有兩類RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前體；snRNA參與hnRNA的剪接（一種加工過程）。自1965年酵母丙氨酸t(yī)RNA的堿基序列確定以后，RNA序列測定方法不斷得到改進(jìn)。目前除多種tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等較小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及較大RNA的一級結(jié)構(gòu)測定已完成，如噬菌體MS2RNA含3569個核苷酸。

種類

在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)主要有三種不同的RNA分子在基因的表達(dá)過程中起重要的作用。它們是信使RNA（messengerRNA，mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）。RNA含有四種基本堿基，即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶和U尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。

RNA的一級結(jié)構(gòu)主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3'，5'磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。天然RNA的二級結(jié)構(gòu)，一般并不像DNA那樣都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，只有在許多區(qū)段可發(fā)生自身回折，使部分A-U、G-C堿基配對，從而形成短的不規(guī)則的螺旋區(qū)。不配對的堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素，也主要是堿基的堆砌力，其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區(qū)至少需要4～6對堿基對才能保持穩(wěn)定。在不同的RNA中，雙螺旋區(qū)所占比例不同?！綬NA的二級結(jié)構(gòu)】細(xì)胞內(nèi)有三類主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。它們各有特點(diǎn)。在大多數(shù)細(xì)胞中RNA的含量比DNA多5～8倍?！敬竽c桿菌RNA的性質(zhì)】

mRNA（信使RNA）

生物的遺傳信息主要貯存于DNA的堿基序列中，但DNA并不直接決定蛋白質(zhì)的合成。而在真核細(xì)胞中，DNA主要貯存于細(xì)胞核中的染色體上，而蛋白質(zhì)的合成場所存在于細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上，因此需要有一種中介物質(zhì)，才能把DNA 上控制蛋白質(zhì)合成的遺傳信息傳遞給核糖體?，F(xiàn)已證明，這種中介物質(zhì)是一種特殊的RNA。這種RNA起著傳遞遺傳信息的作用，因而稱為信使RNA(messenger RNA，mRNA)。

mRNA的功能就是把DNA上的遺傳信息精確無誤地轉(zhuǎn)錄下來，然后再由mRNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，完成基因表達(dá)過程中的遺傳信息傳遞過程。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄形成的前體RNA中含有大量非編碼序列，大約只有25%序列經(jīng)加工成為mRNA，最后翻譯為蛋白質(zhì)。因?yàn)檫@種未經(jīng)加工的前體mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差別很大，所以通常稱為不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）。

tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）

如果說mRNA是合成蛋白質(zhì)的藍(lán)圖，則核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。但是，合成蛋白質(zhì)的原材料——20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，必須用一種特殊的RNA——轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）把氨基酸搬運(yùn)到核糖體上，tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準(zhǔn)確地將它攜帶的氨基酸連結(jié)起來形成多肽鏈。每種氨基酸可與1-4種tRNA相結(jié)合，現(xiàn)在已知的tRNA的種類在40 種以上。

tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均約為27000（25000-30000），由70到90個核苷酸組成。而且具有稀有堿基的特點(diǎn)，稀有堿基除假尿嘧啶核苷與次黃嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。這類稀有堿基一般是在轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)過特殊的修飾而成的。

1969年以來，研究了來自各種不同生物，:如酵母、大腸桿菌、小麥、鼠等十幾種tRNA的結(jié)構(gòu)，證明它們的堿基序列都能折疊成三葉草形二級結(jié)構(gòu)（圖3-23），而且都具有如下的共性：

① 5’末端具有G（大部分）或C。

② 3’末端都以ACC的順序終結(jié)。

③ 有一個富有鳥嘌呤的環(huán)。

④ 有一個反密碼子環(huán)，在這一環(huán)的頂端有三個暴露的堿基，稱為反密碼子（anticodon）.反密碼子可以與mRNA鏈上互補(bǔ)的密碼子配對。

⑤ 有一個胸腺嘧啶環(huán)。

rRNA（核糖體RNA）

核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)是組成核糖體的主要成分。核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。在大腸桿菌中，rRNA量占細(xì)胞總RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA僅占3-5%。

rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成核糖體（ribosome），如果把rRNA從核糖體上除掉，核糖體的結(jié)構(gòu)就會發(fā)生塌陷。原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。S為沉降系數(shù)（sedimentation coefficient），當(dāng)用超速離心測定一個粒子的沉淀速度時，此速度與粒子的大小直徑成比例。5S含有120個核苷酸，16S含有1540個核苷酸，而23S含有2900個核苷酸。而真核生物有4種rRNA，它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1900和4700個核苷酸。

rRNA是單鏈，它包含不等量的A與U、G與C，但是有廣泛的雙鏈區(qū)域。在雙鏈區(qū)，堿基因氫鍵相連，表現(xiàn)為發(fā)夾式螺旋。

rRNA在蛋白質(zhì)合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列與mRNA的前導(dǎo)序列是互補(bǔ)的，這可能有助于mRNA與核糖體的結(jié)合。

snRNA（小核RNA）

除了上述三種主要的RNA外，細(xì)胞內(nèi)還有小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。它是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中RNA剪接體（spilceosome）的主要成分?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有五種snRNA，其長度在哺乳動物中約為100-215個核苷酸。snRNA一直存在于細(xì)胞核中，與40種左右的核內(nèi)蛋白質(zhì)共同組成RNA剪接體，在RNA轉(zhuǎn)錄后加工中起重要作用。另外，還有端體酶RNA(telomeraseRNA)，它與染色體末端的復(fù)制有關(guān)；以及反義RNA(antisenseRNA)，它參與基因表達(dá)的調(diào)控。

有的RNA分子還具有生物催化作用。

上述各種RNA分子均為轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，mRNA最后翻譯為蛋白質(zhì)，而rRNA、tRNA及snRNA等并不攜帶翻譯為蛋白質(zhì)的信息，其終產(chǎn)物就是RNA。

2006諾貝爾醫(yī)學(xué)獎成果RNA干擾機(jī)制解讀

1990年，曾有科學(xué)家給矮牽牛花插入一種催生紅色素的基因，希望能夠讓花朵更鮮艷。但意想不到的事發(fā)生了：矮牽牛花完全褪色，花瓣變成了白色！科學(xué)界對此感到極度困惑。

類似的謎團(tuán)，直到美國科學(xué)家安德魯·法爾和克雷格·梅洛發(fā)現(xiàn)ＲＮＡ（核糖核酸）干擾機(jī)制才得到科學(xué)的解釋。兩位科學(xué)家也正是因?yàn)?998年做出的這一發(fā)現(xiàn)而榮獲今年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

根據(jù)法爾和梅洛的發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家在矮牽牛花實(shí)驗(yàn)中所觀察到的奇怪現(xiàn)象，其實(shí)是因?yàn)樯矬w內(nèi)某種特定基因“沉默”了。導(dǎo)致基因“沉默”的機(jī)制就是ＲＮＡ干擾機(jī)制。

此前，ＲＮＡ分子只是被當(dāng)作從ＤＮＡ（脫氧核糖核酸）到蛋白質(zhì)的“中間人”、將遺傳信息從“藍(lán)圖”傳到“工人”手中的“信使”。但法爾和梅洛的研究讓人們認(rèn)識到，ＲＮＡ作用不可小視，它可以使特定基因開啟、關(guān)閉、更活躍或更不活躍，從而影響生物的體型和發(fā)育等。

諾貝爾獎評審委員會在評價法爾和梅洛的研究成果時說：“他們的發(fā)現(xiàn)能解釋許多令人困惑、相互矛盾的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，并揭示了控制遺傳信息流動的自然機(jī)制。這開啟了一個新的研究領(lǐng)域?！?/p>

科學(xué)家認(rèn)為，ＲＮＡ干擾技術(shù)不僅是研究基因功能的一種強(qiáng)大工具，不久的未來，這種技術(shù)也許能用來直接從源頭上讓致病基因“沉默”，以治療癌癥甚至艾滋病，在農(nóng)業(yè)上也將大有可為。從這個角度來說，“沉默”真的是金。美國哈佛醫(yī)學(xué)院研究人員已用動物實(shí)驗(yàn)表明，利用ＲＮＡ干擾技術(shù)可治愈實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎。

目前，盡管尚有一些難題阻礙著ＲＮＡ干擾技術(shù)的發(fā)展，但科學(xué)界普遍對這一新興的生物工程技術(shù)寄予厚望。這也是諾貝爾獎評審委員會為什么不堅(jiān)持研究成果要經(jīng)過數(shù)十年實(shí)踐驗(yàn)證的“慣例”，而破格為法爾和梅洛頒獎的原因之一。

諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎評審委員會主席戈蘭·漢松說：“我們?yōu)橐环N基本機(jī)制的發(fā)現(xiàn)頒獎。這種機(jī)制已被全世界的科學(xué)家證明是正確的，是給它發(fā)個諾貝爾獎的時候了?！?/p>

相關(guān)信息

核糖核酸

（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。

RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤，G鳥嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成為RNA的特征堿基。

與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是很多RNA也需要通過堿基配對原則形成一定的二級結(jié)構(gòu)乃至三級結(jié)構(gòu)來行使生物學(xué)功能。RNA的堿基配對規(guī)則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。

在細(xì)胞中，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）, rRNA（核糖體RNA）, mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板，內(nèi)容按照細(xì)胞核中的DNA所轉(zhuǎn)錄；tRNA是mRNA上堿基序列（即遺傳密碼子）的識別者和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質(zhì)合成的工作場所。

在病毒方面，很多病毒只以RNA作為其唯一的遺傳信息載體（有別于細(xì)胞生物普遍用雙鏈DNA作載體）。

1982年以來，研究表明，不少RNA，如I、II型內(nèi)含子，RNase P，HDV，核糖體大亞基RNA等等有催化生化反應(yīng)過程的活性，即具有酶的活性，這類RNA被稱為核酶（ribozyme）。

20世紀(jì)90年代以來，又發(fā)現(xiàn)了RNAi（RNA interference，RNA干擾）等等現(xiàn)象，證明RNA在基因表達(dá)調(diào)控中起到重要作用。

在RNA病毒中，RNA是遺傳物質(zhì)，植物病毒總是含RNA。近些年在植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些比病毒還小得多的浸染性致病因子，叫做類病毒。類病毒是不含蛋白質(zhì)的閉環(huán)單鏈RNA分子，此外，真核細(xì)胞中還有兩類RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前體；snRNA參與hnRNA的剪接（一種加工過程）。自1965年酵母丙氨酸t(yī)RNA的堿基序列確定以后，RNA序列測定方法不斷得到改進(jìn)。目前除多種tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等較小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及較大RNA的一級結(jié)構(gòu)測定已完成，如噬菌體MS2RNA含3569個核苷酸。

核糖核酸

Ribonucleic Acid (RNA)

本品能促進(jìn)肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，改善氨基酸代謝，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，改善肝炎患者血清蛋白電泳，并能調(diào)節(jié)人體免疫功能，促使病變肝細(xì)胞恢復(fù)正常。臨床用于急慢性肝炎，肝硬化的治療。肌內(nèi)注射，6mg/次，以生理鹽水稀釋，隔日1次，3個月為1療程。

RNA干擾（RNAi）

RNAi的定義

目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種，不同的資料對其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義：① RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。② RNAi是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。

如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為：① RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA 形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA 和反義RNA) ,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA 降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。② RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。③ RNAi是將與靶基因的mRNA 同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA ) 導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失, 屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。

各種不同定義雖然說法不同，但所描述事實(shí)是大體相同的，簡單地可以說，RNAi就是指由RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象。

最近由于RNA干擾（RNA interference，RNAi）的發(fā)現(xiàn)使反義領(lǐng)域的研究增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象最早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的（1），是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因沉默的有力機(jī)制。由于最近兩年在RNAi領(lǐng)域取得的進(jìn)步，已經(jīng)有許多這方面的綜述發(fā)表（2-4）。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發(fā)動的，該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA（見圖）。RNaseIII蛋白被認(rèn)為是作為一個二聚體發(fā)揮作用，它對雙鏈RNA的兩個鏈都進(jìn)行切割，酶切的產(chǎn)物3'末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA。

這種保守的生化機(jī)制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用受到阻礙，因?yàn)殚L的雙鏈RNA分子會引起干擾素應(yīng)答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)是一個革命性的突破（5）。這個發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用RNAi技術(shù)對哺乳動物細(xì)胞的研究，因?yàn)榕c傳統(tǒng)的反義技術(shù)比，RNAi的性能明顯較高。

有趣的是，除了短雙鏈RNA，短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如莖環(huán)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA，從而產(chǎn)生RNA干擾（6、7）。這使得構(gòu)建表達(dá)干擾RNA的載體，從而使哺乳動物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)長期沉默成為可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉(zhuǎn)錄，在正常情況下，該啟動子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1 RNA（11）轉(zhuǎn)錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動子轉(zhuǎn)錄出來（6、12、13）。載體介導(dǎo)的siRNA表達(dá)使對功能缺失（loss-of-function）表型進(jìn)行長期分析成為可能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)，兩個月后仍可觀察到沉默現(xiàn)象（11）。

另外一種延長siRNA抑制基因表達(dá)時間的方法是對化學(xué)合成的RNA進(jìn)行核苷酸修飾。盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RNA在細(xì)胞培養(yǎng)物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對siRNA的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷（14）。一個5'端為兩個2'-O-甲基RNA、3'端為4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA比活性相同，但是在細(xì)胞培養(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時間延長。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導(dǎo)致siRNA活性下降。

RNA干擾在哺乳動物體內(nèi)的第一個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈（15、16）。在大多數(shù)器官中，報道基因（編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)基因小鼠上）的表達(dá)可以被有效地抑制。另外，F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標(biāo)進(jìn)行了RNA干擾實(shí)驗(yàn)（17）。注射siRNA之后，小鼠肝細(xì)胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護(hù)小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對照小鼠在3天之內(nèi)死亡。

上述研究中采用的高壓導(dǎo)入技術(shù)是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標(biāo)準(zhǔn)的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個反轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于導(dǎo)入siRNA，以抑制人類胰腺腫瘤細(xì)胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。負(fù)調(diào)控癌細(xì)胞中K-ras基因的表達(dá)使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項(xiàng)研究還表明siRNA的高度特異性，因?yàn)橹挥邪┗騅-ras被沉默，而與之只有1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當(dāng)在紋狀區(qū)注射表達(dá)siRNA的腺病毒之后，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFP基因的表達(dá)可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達(dá)元件被用于這個實(shí)驗(yàn)，為設(shè)計組織特異性或者可誘導(dǎo)的siRNA載體打開了大門。

總的來說，siRNA的第一個體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標(biāo)開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應(yīng)用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗(yàn)開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA干擾引起的嚴(yán)重副作用。因?yàn)橛胹iRNA使基因表達(dá)沉默與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相似，研究者將從十多年來反義技術(shù)研究的教訓(xùn)中獲益，比如需要使用合適的對照以證明基因表達(dá)的敲除是特異性的，以及對免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進(jìn)行詳細(xì)分析。

總結(jié)

經(jīng)過長期盛衰沉浮，反義技術(shù)近年來得到越來越多的注意。對能夠提高靶表親和性和生物穩(wěn)定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進(jìn)展。由于大多數(shù)新的DNA類似物不能激活RNaseH，對反義寡核苷酸的設(shè)計需要考慮靶mRNA是否需要保留，例如，是改變剪接方式，還是降解靶mRNA（這種情況下應(yīng)該使用gapmer技術(shù)）?？梢酝ㄟ^有系統(tǒng)的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術(shù)獲得具有高催化活性的穩(wěn)定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究，一個反義藥物已經(jīng)在1998年獲得批準(zhǔn)。一個重要的突破是發(fā)現(xiàn)短的雙鏈RNA分子可用于哺乳動物細(xì)胞中特異性沉默基因表達(dá)。這個方法與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比效率明顯更高，并且一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。因此，反義技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于對未知功能基因的研究、藥物靶標(biāo)的確認(rèn)和治療。

miRNAmicroRNAs（miRNAs）是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在植物、動物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，miRNA組織特異性和時序性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。

miRNA原理

miRNA基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II(polII)轉(zhuǎn)錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA。RAN–GTP和exportin 5將pre-miRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個核酸酶Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入沉默復(fù)合體(RISC)復(fù)合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過堿基配對調(diào)控基因表達(dá)。

與靶mRNA不完全互補(bǔ)的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)（哺乳動物中比較普遍）。然而，最近也有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機(jī)制的miRNA結(jié)合位點(diǎn)通常在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)（或者幾乎完全互補(bǔ)），那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。通過這種機(jī)制作用的miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。隨著miRNA調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

目前只有一小部分miRNAs生物學(xué)功能得到闡明。這些miRNAs調(diào)節(jié)了細(xì)胞生長，組織分化，因而與生命過程中發(fā)育、疾病有關(guān)。通過對基因組上miRNA的位點(diǎn)分析，顯示其在發(fā)育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在細(xì)胞生長和凋亡，血細(xì)胞分化，同源異形盒基因調(diào)節(jié)，神經(jīng)元的極性，胰島素分泌，大腦形態(tài)形成，心臟發(fā)生，胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。例如，miR-273和lys-6編碼的miRNA，參與線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程；miR-430參與斑馬魚的大腦發(fā)育；miR-181控制哺乳動物血細(xì)胞分化為B細(xì)胞；miR-375調(diào)節(jié)哺乳動物胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌；miR-143在脂肪細(xì)胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動物四肢形成，miR-1與心臟發(fā)育有關(guān)。另有研究人員發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs在大腦皮層培養(yǎng)中受到時序調(diào)節(jié)，表明其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯。對于新的miRNA基因的分析，可能發(fā)現(xiàn)新的參與器官形成、胚胎發(fā)育和生長的調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)對癌癥等人類疾病發(fā)病機(jī)制的理解。

miRNA特點(diǎn)：

廣泛存在于真核生物中, 是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA , 它本身不具有開放閱讀框架(ORF) ;

通常的長度為20～24 nt , 但在3′端可以有1～2 個堿基的長度變化;

成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團(tuán), 3′端為羥基, 這一特點(diǎn)使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA 的降解片段區(qū)別開來；

多數(shù)miRNA 還具有高度保守性、時序性和組織特異性。

RNA的提取

一、準(zhǔn)備試劑：

氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過的水配制）。

二、操作步驟：

1. 勻漿處理：

a. 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b. 單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c. 細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。

10. 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

三、注意事項(xiàng)：

1. 從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。

2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機(jī)，2600×g離心30-60分鐘。

預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為：

肝和脾6-10μg ，腎3-4μg ，骨骼肌和腦組織1-1.5μg ，胎盤1-4μg ，上皮細(xì)胞8-15μg ，成纖維細(xì)胞5-7μg 。

四、常見問題分析：

1. 得率低：

A. 樣品裂解或勻漿處理不徹底

B. RNA沉淀未完全溶解

2. A260/A280<1.65 ：

A. 檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

B. 樣品勻漿時加的試劑量太少

C. 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘

D. 吸取水相時混入了有機(jī)相

E. RNA沉淀未完全溶解。

3. RNA降解：

A. 組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B. 待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃

C. 細(xì)胞在用胰酶處理時過度

D. 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理

E. 電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

4. DNA污染：

A. 樣品勻漿時加的試劑量太少

B. 樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液

5. 蛋白聚糖和多糖污染：

沉淀RNA的過程中作以下改進(jìn)可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl）混合離心，按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。其它 RNA

英國皇家海軍航空兵的簡稱

“英國方面參加馬島戰(zhàn)爭的當(dāng)然主角——皇家海軍（RN）和海軍航空兵（RNA）。”摘錄自空軍之翼網(wǎng)站《?？颂m戰(zhàn)爭中的空中力量》