活性氧

定義

活性氧（reactive oxygen species，ROS）廣泛指代氧來源的自由基和非自由基，包含了超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2），由于它們含有不成對(duì)的電子，因而具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性。

在機(jī)體內(nèi)，ROS的主要來源之一是線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈底物端，在線粒體中的電子傳遞鏈復(fù)合物將電子傳遞給O2的過程中，有一部分O2被還原，形成O2-或H2O2。其中，最為重要的是O2-，它是大部分的ROS的前體，主要由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的蛋白酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ產(chǎn)生。這部分作為代謝副產(chǎn)物的ROS長期被當(dāng)作損傷生物大分子的毒性分子，但近年來被認(rèn)為在較低水平時(shí)作為一類信號(hào)小分子具有生理作用，另一個(gè)ROS的重要來源是NADPH化酶，其催化亞基被稱為NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能夠在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。在不同的組織中已經(jīng)鑒定了6種NOX-2的同瀝物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，統(tǒng)稱為NOX家族蛋白。這些酶能通過質(zhì)傳遞電子產(chǎn)生ROS，可以大量存在于吞噬細(xì)胞，也在其他各種組織細(xì)胞中以較低水平普遍存在，參與很多膜受體下游信號(hào)激活。

ROS保護(hù)細(xì)胞免受病原體的侵害，但較高濃度的ROS會(huì)誘發(fā)許多疾病，例如惡性腫瘤，糖尿病，關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈粥樣硬化，心臟病并增強(qiáng)衰老過程。5

產(chǎn)生

活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）是O2，帶電子后的產(chǎn)物，包括氧的一電子產(chǎn)物氧負(fù)離子O2-、二電子產(chǎn)物過氧化氫（H2O2，）、三電子產(chǎn)物羥基自由基（OH-）、一氧化氮等，半衰期較短，脂溶性。體內(nèi)活性氧主要是在線粒體電子傳遞鏈由Ⅲ狀態(tài)向狀態(tài)IV轉(zhuǎn)換中產(chǎn)生，線粒體高O2的環(huán)境，使高還原態(tài)的呼吸鏈有電子由呼吸鏈底物端和氧端漏出，并交給O2，而生成O2-。正常時(shí)，約2%的氧參與活性氧的產(chǎn)生；生理?xiàng)l件下，適量的活性氧可促進(jìn)免疫、修復(fù)、存活、生長等。消除活性氧的抗氧化體系分為酶系和非酶系，酶系有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等，非酶系主要是還原型谷胱甘肽（GSH）、維生素C/E等。細(xì)胞內(nèi)高水平谷胱甘肽GSH，CAT（H2O2酶）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶SOD、環(huán)孢素、抗凋亡因子Bcl-2，可下調(diào)活性氧的產(chǎn)生水平。

線粒體中活性氧的產(chǎn)生

體內(nèi)90%以上的O2，在線粒體中被消耗。O2一方面作為呼吸鏈的終端電子受體參與產(chǎn)生ATP的氧化磷酸化反應(yīng)，維持能量代謝；另一方面，O2通過一系列化學(xué)反應(yīng)，有時(shí)可生成氧自由基、活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、脂類（RH）過氧化物等，脂類過氧化物有烷氧基（RO-）/烷過氧基（ROO-）/氫過氧化物（ROOH）等。線粒體產(chǎn)生活性氧的速率，受線粒體內(nèi)膜跨膜電位的調(diào)節(jié)。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的異咯秦半醌（FAD）、泛醌、復(fù)合物Ⅲ的細(xì)胞色素b566、輔酶Q氧化時(shí)漏電子，可產(chǎn)生活性氧；線粒體NADPH氧化酶和黃嘌呤氧化酶可催化生成O2-，線粒體的髓過氧化物酶MPO可催化生成OH-，線粒體蛋白激酶C可催化生成H2O2。

線粒體受外界因素刺激時(shí)，包括射線、高壓氧、香煙煙霧、空氣污染、鉛、鉻、釩、抗癌藥、抗生素、殺蟲劑、麻醉藥、高血糖、炎癥因子、腫瘤壞死因子TNF-a/MLR（microcystin）、高血脂、缺血、乙醛、缺氧等，活性氧產(chǎn)生明顯增加。血管內(nèi)皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子B受體、胰島素樣生長因子受體、胰島素受體、血管緊張素受體ATIR、瘦素受體通路等高度活化時(shí)，也可使活性氧產(chǎn)生明顯增加。

測定方法

在生物系統(tǒng)中，游離活性氧量很低，因此測定時(shí)需要靈敏的方法如脈沖射解、電子自旋共振等技術(shù)，但儀器較昂貴。由線粒體產(chǎn)生的H2O2，存在時(shí)間較長，能使DCFH探針的熒光物被氧化成DCF（二氯熒光素雙乙酸鹽），DCF可被酯酶裂解成二氯熒光素，以二氯熒光素為基礎(chǔ)的熒光法，可檢測H2O2、O2-和OH-，這種方法較簡單，但特異性較低。以亞鐵血紅素過氧化物酶/辣根過氧化物酶催化H2O2氧化熒光物、產(chǎn)生熒光素的熒光法，特異性和靈敏度較高;通過測定活性氧損傷的產(chǎn)物如脂質(zhì)過氧化物（oxLDL）和DNA損傷產(chǎn)物（8-羥基鳥嘌呤）等，可間接反映活性氧產(chǎn)量。不成對(duì)電子使H2O2，等帶有順磁共振特性，可被EPR光譜法測量，但需要特殊的設(shè)備。使用氧化還原反應(yīng)中分子間能量轉(zhuǎn)移，使發(fā)光氨還原后可與O2-，反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)物并發(fā)光，這種方法非常靈敏，已經(jīng)用于測定完整細(xì)胞、單獨(dú)的線粒體及線粒體亞顆粒中的O2-含量。

活性氧與線粒體凋亡通路

線粒體是過量的活性氧主要的促凋亡靶，可誘導(dǎo)線粒體雙層膜通透孔（PT孔）開放，釋放鈣離子、細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子AIF，引起胱冬蛋白酶caspase9激活caspase3/6/7；可使線粒體電子傳遞鏈解耦聯(lián)，下調(diào)ATP產(chǎn)生水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，最后使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

線粒體雙層膜通透孔有2個(gè)氧化敏感位點(diǎn):一個(gè)位點(diǎn)有吡啶核苷酸結(jié)合基序，可結(jié)合NAD/NADH和NADP+/NADPH；另一個(gè)位點(diǎn)有谷胱甘肽結(jié)合基序，可結(jié)合谷胱甘肽?；钚匝跄苁咕€粒體雙層膜通透孔結(jié)合的NADH，NADPH、谷胱甘肽氧化，促使線粒體雙層膜通透孔開放。活性氧增加既是線粒體雙層膜通透孔開放的原因，也是其結(jié)果。高水平腫瘤壞死因子TNF-a/MLR可上調(diào)活性氧的產(chǎn)生水平。高水平活性氧也可刺激死亡受體通路，引起細(xì)胞凋亡。過量的活性氧也可誘導(dǎo)線粒體外膜孔開放，釋放鈣離子、細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因了AIF，引起細(xì)胞凋亡。

活性氧作用的靶標(biāo)

過量的活性氧可與線粒體電子傳遞鏈多種蛋白硫氧還中心的Fe-S簇的Cys殘基反應(yīng)，形成蛋白的S-谷胱甘肽化的加合物。過量的活性氧，可損傷生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類等。

生長因子等

適量的活性氧可通過活化表皮生長因子受體EGFR，激活磷脂酶PLA2/PLD，分解膜磷脂產(chǎn)生甘油二酯、三磷酸肌醇，活化蛋白激酶C，使DNA依賴的蛋白激酶和DNA斷端結(jié)合蛋白形成的復(fù)合體增加，促進(jìn)對(duì)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞存活。

活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，可促使磷酸酶PTPIB、PTEN、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cde25失活，促進(jìn)蛋白酪氨酸激酶PTK過度磷酸化活化，可促進(jìn)NADPH氧化酶產(chǎn)生大量活性氧，過度活化鈣離于/鈣調(diào)蛋白激酶CaMK，引起生長抑制蛋白p21，p27表達(dá)水平上調(diào)，使生長因子、轉(zhuǎn)錄因子AP-1/c-Myb/Sp-1/EGR-1等降解、細(xì)胞骨架形成障礙、細(xì)胞周期停滯、生長受抑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

蛋白酪氨酸激酶、轉(zhuǎn)錄因子等

適量的活性氧可激活非受體酪氨酸激酶Src等，再通過結(jié)合下游信號(hào)蛋白，激活Ras/蛋白激酶MAPK.使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，促進(jìn)靶基因表達(dá)、但活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，使Src/Ras/蛋白激酶p38MAPK和蛋白激酶JNK過度激活，能氧化損傷轉(zhuǎn)錄因子cMyb、Sp-1、EGR-1、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1、cFos，cJun、AP-1等的半胱氨酸-SH基，使它們喪失與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合力，抑制靶基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

蛋白激酶C

適量的活性氧可激活蛋白激酶C，引發(fā)一系列蛋白質(zhì)磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖;高濃度的活性氧使蛋白激酶C過度活化，可使胱冬蛋白酶caspase依賴的凋亡通路活化，促細(xì)胞凋亡。

PI3K

適量的活性氧可激活蛋白激酶PI3K信號(hào)通路，抗輻射?；钚匝踹^度產(chǎn)生時(shí)，過度上調(diào)蛋白激酶P13K/Akt的水平，可引發(fā)放射線照射后的細(xì)胞凋亡?；钚匝踹^度產(chǎn)生時(shí)，也可與Fe2+進(jìn)行自由基反應(yīng)，產(chǎn)生毒性O(shè)H-，可造成DNA突變、斷裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Ca+/CaM，oxLDL

活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，能氧化鈣調(diào)蛋白CaM的Met殘基，使之持續(xù)活化，可過度激活鈣調(diào)蛋白激酶CaMK，促細(xì)胞凋亡。活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，能氧化產(chǎn)生氧化型低密度脂蛋白o(hù)xLDL，并通過清道夫受體LOX-1，上調(diào)促凋亡因子p53，Bax的表達(dá)水平；能使抗氧化酶如SOD，CAT，GPx的Cys殘基，形成二硫鍵而失活，降低細(xì)胞抗氧化力;也可使端粒酶活性下降，抑制細(xì)胞生長;也能上調(diào)凋亡誘導(dǎo)因子AIF活性，使PGC1a/鋅結(jié)合蛋白KEAPI/核受體因子NRF2/鈣離子/鈣調(diào)蛋白激酶/叉頭盒蛋白FoxO通路持續(xù)活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

膠原合成

活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，還可經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3、蛋白激酶ERK1/2、黏附斑激酶FAK、蛋白激酶P13K/Akt、蛋白激酶p38MAPK、蛋白激酶C8、核因子NF-kB等，促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)纖維化。

還原物

與細(xì)胞外環(huán)境相比，細(xì)胞質(zhì)通常處在還原狀態(tài)，這由細(xì)胞內(nèi)的疏基化合物的還原能力來維持，主要有谷胱甘肽、維生素C/E、硫氧還蛋白（TRX），可下調(diào)H2O2，和脂質(zhì)過氧化物的水平，抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激?；钚匝踹^度產(chǎn)生時(shí)，可引起還原物谷胱甘肽、維生素C/E、硫氧還蛋白的耗竭，增加細(xì)胞對(duì)活性氧的敏感度。

蛋白質(zhì)、DNA

活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，可誘導(dǎo)大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，氧化蛋白質(zhì)的Ser和Cys殘基上的功能基團(tuán)，引起構(gòu)型、信號(hào)改變;可使核因子NF-kB、蛋白激酶C催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)Cys殘基形成二硫鍵，上調(diào)NF-kB，蛋白激酶C的活性，催化產(chǎn)生H2O2，活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，也可直接氧化、活化缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1中的Cys殘基，促進(jìn)炎癥及凋亡;能氧化某些酶中的[4Fe2+-4S]中心，導(dǎo)致Fe2+的釋放，F(xiàn)e2+可經(jīng)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧；Fe2+的釋放也可引起某些金屬蛋白質(zhì)失活?；钚匝踹^度產(chǎn)生時(shí)，也可氧化信號(hào)分子、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類等，使之受損。

活性氧與細(xì)胞質(zhì)Ca+水平

活性氧過度產(chǎn)生時(shí)，通過上調(diào)三磷酸肌醇，使胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜三磷酸肌醇受體-鈣離子通道開放，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放鈣離子，細(xì)胞質(zhì)高水平鈣離子/鈣調(diào)蛋白激酶CaMK，可使質(zhì)膜L型電壓門控鈣離子通道開放，胞外鈣離子流入，可誘發(fā)線粒體雙層膜通透孔開放，使線粒體腫脹、破裂，線粒體膜間腔鈣庫釋放鈣離子，可使細(xì)胞質(zhì)Ca2+超載，活性氧大量產(chǎn)生。

胞質(zhì)高水平鈣離子可活化蛋白激酶JNK/FoxO及巨噬細(xì)胞刺激因子MST1/FoxO等信號(hào)通路，促細(xì)胞凋亡；可使鋅結(jié)合蛋白KEAP1的Cys151/273/288殘基被氧化、活化，可釋放Zn2+并抑制核受體因子NRF2，并經(jīng)Ⅱ相異生化酶、缺氧/UV輻射相關(guān)蛋白等，阻斷DNA修復(fù)，促細(xì)胞凋亡。近年發(fā)現(xiàn)活性氧的信號(hào)通路可被氧化磷酸化的解耦聯(lián)劑FCCP阻斷，并減少胞質(zhì)鈣離子。3