基因編輯

簡介

基因編輯（Gene Editing）是指通過基因編輯技術(shù)對生物體基因組特定目標進行修飾的過程。高效而精準的實現(xiàn)基因插入、缺失或替換，從而改變其遺傳信息和表現(xiàn)型特征。

基因編輯技術(shù)是一種革命性的生物技術(shù)，用于修改生物體的基因組。它基于多種工具，使科學(xué)家能夠針對特定的基因序列進行精確的編輯和改變。

基因編輯過程：在基因組中特定位置產(chǎn)生位點特異性雙鏈斷裂（DSB），通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）來修復(fù)DSB，同時完成基因編輯。

基因編輯技術(shù)具有巨大的潛力，可以在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和其他領(lǐng)域產(chǎn)生革命性的影響。然而，這項技術(shù)需要仔細權(quán)衡倫理和安全，并加強監(jiān)管措施，以確保其安全性和可持續(xù)性。

技術(shù)原理

同源重組技術(shù)（homologous recombination，HR）是較早使用的基因編輯技術(shù)，其原理是將外源性目的基因?qū)胧荏w細胞，通過同源序列交換，使外源性DNA片段取代原位點上的基因，從而達到使特定基因失活或修復(fù)缺陷基因的目的。由于效率極低，且出錯率高，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。

20世紀80年代末、90年代初，人們發(fā)現(xiàn)通過在特定的基因組靶點誘導(dǎo)雙鏈斷裂(double-stranded break，DSB)能在染色體水平上實現(xiàn)高效和準確的基因修飾。

DSB被誘導(dǎo)后，細胞內(nèi)將啟動兩種主要的修復(fù)機制：非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組（homology directed repair，HDR）。NHEJ不依賴模板直接連接DNA兩端，可以在DSB位點有效產(chǎn)生不同長度片段的插入或缺失，通常導(dǎo)致基因功能失活，快速但不精確；HDR依賴于模板進行定向修復(fù)，可以實現(xiàn)特定位點的精確插入、缺失或者堿基置換，更精確。

此后，科學(xué)家便專注于開發(fā)各種基于核酸內(nèi)切酶機制的基因編輯技術(shù)，以實現(xiàn)對特定基因組位點DSB的精確誘導(dǎo)。

技術(shù)鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）

技術(shù)鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）。

**背景：**1984年，科學(xué)家在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白，經(jīng)過人工改造并與核酸內(nèi)切酶連接，發(fā)展成鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc Finger Nuclease, ZFN）。

**結(jié)構(gòu)：**鋅指核酸酶由兩個部分組成：鋅指蛋白（Zinc Finger Protein, ZFP）和Fok1核酸內(nèi)切酶。鋅指蛋白是由多個鋅指結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成，用于識別和結(jié)合特定的基因序列。Fok1核酸內(nèi)切酶具有特異性的切割能力，通過二聚化形成一個有效的切割復(fù)合物，可以切割真核基因組中的任何特定識別序列。鋅指蛋白中的DNA識別域由一系列Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)組成（通常為3-4個），每個鋅指結(jié)構(gòu)識別并結(jié)合特定的三個堿基。

**工作原理：**多個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)串聯(lián)形成一個鋅指蛋白組，能夠識別特定的堿基序列，具有高度的特異性。非特異性核酸內(nèi)切酶來自Fok1，它位于C端，由96個氨基酸殘基組成切割域。Fok1是一種來自海床黃桿菌的限制性內(nèi)切酶，只有在二聚體狀態(tài)下才具有切割活性。每個Fok1單體與一個鋅指蛋白組相連形成一個ZFN，它們識別特定的位點，當兩個識別位點之間的距離適當（6-8個堿基）時，兩個ZFN單體相互作用形成切割功能，實現(xiàn)DNA的定點切割。

**優(yōu)勢：**能夠在指定的位點引發(fā)DNA雙鏈斷裂，促使細胞啟動自然的DNA修復(fù)過程，包括同源重組和非同源末端連接，從而誘導(dǎo)位點特異性的基因重組。相對于傳統(tǒng)方法，鋅指核酸酶技術(shù)提高了基因組定點修飾的效率3-5個數(shù)量級，并有極高的特異性?？梢栽?-8周內(nèi)實現(xiàn)永久、可遺傳的基因刪除、插入和修飾。

局限性：（1）鋅指核酸酶存在上下文依賴效應(yīng)，即鋅指蛋白之間的相互作用可能影響對特定核苷酸序列的識別和結(jié)合。（2）在人類基因組中，每隔至少500個堿基才能結(jié)合一個ZFN靶點，由模塊組裝的ZFN不能直接切割染色體。

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALEN）。

**背景：**2007年，在植物黃單胞菌（Xanthomonas）中發(fā)現(xiàn)一種特殊的分泌蛋白質(zhì)，被稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（Transcription activator-Like effector, TALE）。這種蛋白質(zhì)具有結(jié)合植物宿主基因組并激活轉(zhuǎn)錄的能力。2009年，TALE與DNA結(jié)合的機制被闡明。2012年，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物技術(shù)出現(xiàn)，逐漸取代了鋅指核酸酶技術(shù)。

結(jié)構(gòu)及工作原理：TALEN由兩個部分組成：特異性識別和結(jié)合DNA的區(qū)域，即TALE；與ZFN相同的IIＳ型Fok1核酸酶，通過二聚化作用使目標DNA片段發(fā)生雙鏈斷裂。然后，利用細胞內(nèi)的修復(fù)機制修復(fù)損傷。

局限性：（1）最初TALEN蛋白只能識別“胸腺嘧啶”。（2）在TALEN上連接重組酶或位點特異性轉(zhuǎn)座酶，可自動完成對基因組的切割和連接，可以在任何細胞中使用（即使在沒有NHEJ和HDR修復(fù)通路的細胞中），擴大了TALEN的應(yīng)用范圍。然而，這些酶會產(chǎn)生較為明顯的脫靶效應(yīng)。

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶工作原理圖：TALEN由N端轉(zhuǎn)運信號、Ｃ端核定位信號、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和 DNA特異性識別結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列-相關(guān)核酸酶

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列-相關(guān)核酸酶技術(shù)（CRISPR-Cas）。

背景：CRISPR-Cas系統(tǒng)（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein）由兩部分構(gòu)成：，即成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）及相關(guān)蛋白（Cas）。CRISPR序列由高度保守的重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）組成。其中，間隔序列來源于外源基因。CRISPR序列附近還有一些相關(guān)基因，編碼一系列Cas蛋白（核酸酶）。該系統(tǒng)最初是從細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以抵御病毒和質(zhì)粒DNA的入侵。它的工作過程分為三個階段：（1）獲??；根據(jù)外源基因的原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motifs，PAM）確定原間隔序列，Cas蛋白將其切割，整合到CRISPR序列中。（2）表達：間隔序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、加工成為成熟的crRNA，識別外源基因。（3）干擾：crRNA與特異性Cas蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物，特異性切割外源基因。

**結(jié)構(gòu)及工作原理：**CRISPR-Cas9包含兩種重要組分：行使核酸內(nèi)切酶功能的Cas9蛋白；具有導(dǎo)向功能的sgRNA（由tracrRNA和crRNA連接而成）。Cas9由1409個氨基酸組成，包含兩個關(guān)鍵的核酸酶結(jié)構(gòu)域（RuvC和HNH）。HNH結(jié)構(gòu)域負責(zé)切割與其互補的DNA單鏈，切割位點位于PAM（protospacer adjacent motifs）序列上游3個核苷酸處。RuvC結(jié)構(gòu)域則負責(zé)切割另一條DNA鏈，切割位點位于PAM序列上游3-8個核苷酸處。

局限性：（1）對PAM序列的依賴性和脫靶效應(yīng)。（2）存在嵌合體現(xiàn)象。

技術(shù)應(yīng)用

遺傳疾病治療

基因編輯可以用于修復(fù)或糾正導(dǎo)致遺傳疾病的突變基因。例如，可以使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來修復(fù)單基因疾?。ㄈ缒倚岳w維化、遺傳性失聰?shù)龋┲械耐蛔兓?，恢?fù)其正常功能。

癌癥治療

基因編輯可用于研究和治療癌癥。例如，科學(xué)家可以利用基因編輯技術(shù)來研究腫瘤抑制基因和腫瘤促進基因，以了解其對癌癥發(fā)展的影響，并開發(fā)新的治療方法。

農(nóng)作物改良

基因編輯可以用于改良農(nóng)作物，提高其產(chǎn)量、耐病性和適應(yīng)性。通過編輯農(nóng)作物基因組中的關(guān)鍵基因，可以使其具備更好的抗蟲性、耐旱性、耐鹽性等特性。

遺傳調(diào)控研究

基因編輯可用于研究基因在生物體發(fā)育和功能中的作用。通過刪除、插入或改變特定基因的序列，科學(xué)家可以研究基因?qū)€體發(fā)育、生理過程和疾病發(fā)展的影響。

生物學(xué)研究工具：基因編輯技術(shù)提供了研究生物學(xué)基本原理的有力工具。通過編輯模型生物（如小鼠、果蠅、線蟲等）的基因，科學(xué)家可以研究基因功能、信號傳導(dǎo)途徑和疾病機制等。

生物能源生產(chǎn)

基因編輯可以用于改良微生物，使其能夠更有效地產(chǎn)生生物燃料或其他有用的化合物。

技術(shù)突破

（1）2016年，研發(fā)的堿基編輯器base editor（BE）是一種可以在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下實現(xiàn)單堿基水平堿基替換的工具，其在基礎(chǔ)研究和基因治療領(lǐng)域顯示出了極大的潛力。堿基編輯器主要有3種類型：胞嘧啶堿基編輯器 cytosine base editor（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器adenine base editor（ABE）和糖基化酶堿基編輯器glycosylase base editor（GBE），它們在不需要DNA雙鏈斷裂和編輯模板的情況下可分別實現(xiàn)C-to-T，A-to-G和C-to-G的堿基編輯。

（2）2019年，據(jù)英國《自然》雜志21日發(fā)表的一項研究，美國博德研究所核心成員、華人生物學(xué)家劉如謙及其同事，提出一項新型編輯技術(shù)——“先導(dǎo)編輯Prime Editor（PE）”，支持靶向點突變、精準插入、精準刪除及其各種組合，而不造成DNA雙鏈斷裂。報告稱，這項技術(shù)比傳統(tǒng)Cas9編輯技術(shù)效率更高，副產(chǎn)物更少，脫靶率更低。

（3）2021年，美國博德研究所的研究人員開發(fā)了一種新版本的先導(dǎo)編輯：雙先導(dǎo)編輯（twin prime editing, twinPE），它可以整入或置換出基因大小的DNA序列。3

（4）2022年，中國科學(xué)院賴良學(xué)課題組將腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和糖苷酶堿基編輯器（CGBE）結(jié)合，開發(fā)出新型的雙堿基編輯器——AGBE。它可以利用單個向?qū)NA（sgRNA）誘導(dǎo)同一等位基因的靶序列單獨或同時發(fā)生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4種不同類型的堿基轉(zhuǎn)換。4

未來發(fā)展

未來的優(yōu)化方向：提高編輯效率、降低脫靶風(fēng)險（增強靶向性/特異性）、降低對細胞的擾動、優(yōu)化遞送方式（提高治療效率）。

風(fēng)險和爭議

（1）在技術(shù)層面，基因編輯技術(shù)的倫理問題在于技術(shù)上尚不完善，可能導(dǎo)致應(yīng)用過程中的諸多不確定性。

①準確率不足導(dǎo)致的“脫靶效應(yīng)”5

脫靶效應(yīng)是指，基因編輯工具在編輯目標基因時，無法精確到只和靶序列結(jié)合，切割操作并不精準，依靠外源DNA做同源修復(fù)效率低，可能會誤切或者誤編輯到非目標區(qū)域，從而導(dǎo)致非預(yù)期的基因編輯。

②編輯效率低下產(chǎn)生的“嵌合效應(yīng)”6

由于胚胎細胞的特殊性質(zhì)，基因編輯技術(shù)在編輯人類胚胎時，可能會導(dǎo)致未完全編輯細胞的“嵌合效應(yīng)”。嵌合體：不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個體，亦指染色體異常類型之一。

③CRISPR/Cas9系統(tǒng)進入人體內(nèi)導(dǎo)致的“免疫效應(yīng)”7

④編輯特定功能性基因?qū)е碌牟豢深A(yù)知的“副作用”8

（2）在社會層面，基因編輯技術(shù)可能會對社會公平與正義產(chǎn)生沖擊，導(dǎo)致社會發(fā)展倫理問題的出現(xiàn)。例如，基因編輯手段可能加劇社會中存在的偏見和狹隘，加劇家庭觀念及共同利益的沖擊，動搖技術(shù)的平等獲取和社會正義。

（3）在生態(tài)層面，基因編輯技術(shù)可以改變物種的基因庫，帶來不可控的風(fēng)險后果。例如，基因編輯所帶來的“多代效應(yīng)”后果難以評估，可能會人為增加人類出現(xiàn)遺傳問題的風(fēng)險；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用可能會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響，損害整體的自然生態(tài)，人為定向基因選擇可能會導(dǎo)致基因的多樣性消失；基因編輯食品所涉及的食品安全和監(jiān)管，以及間接引發(fā)的法律規(guī)制等問題。9

典型事件

2018年11月26日，南方科技大學(xué)副教授賀建奎在香港舉行的國際基因組編輯峰會上宣布，他已經(jīng)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，成功地將一對名為“露露”和“娜娜”雙胞胎女嬰的CCR5基因進行了改造，于中國誕使其具有抗HIV的能力。第一對基因編輯嬰兒在中國誕生，這一事件引起了全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注和爭議。

2022年10月，一位名叫Terry Horgan的27歲杜氏肌營養(yǎng)不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）患者在接受腺相關(guān)病毒（AAV9）載體遞送的CRISPR基因編輯治療后不幸去世。雖然目前尚不清楚Terry Horgan去世的真正原因，以及是否與CRISPR有關(guān)，但它的去世無疑引發(fā)了人們對CRISPR基因編輯療法前景的擔(dān)憂和質(zhì)疑。

法律規(guī)定

2020年12月26日，第十三屆全國人民代表大會常務(wù)委員會第二十四次會議通過《中華人民共和國刑法修正案（十一）》，在刑法第三百三十六條后增加一條，作為第三百三十六條之一：“將基因編輯、克隆的人類胚胎植入人體或者動物體內(nèi)，或者將基因編輯、克隆的動物胚胎植入人體內(nèi)，情節(jié)嚴重的，處三年以下有期徒刑或者拘役，并處罰金；情節(jié)特別嚴重的，處三年以上七年以下有期徒刑，并處罰金”。

2021年2月22日，最高人民法院審判委員會第1832次會議、2021年2月26日最高人民檢察院第十三屆檢察委員會第六十三次會議通過的《最高人民法院最高人民檢察院關(guān)于執(zhí)行，<中華人民共和國刑法>確定罪名的補充規(guī)定（七）》規(guī)定了非法植入基因編輯、克隆胚胎罪罪名。

2021年7月12日，世界衛(wèi)生組織發(fā)布兩份互相關(guān)聯(lián)的報告《人類基因編輯管治框架》與《人類基因編輯建議》，就如何在全球范圍內(nèi)使人類基因編輯技術(shù)成為促進公共健康的工具提出了首份建議，重點強調(diào)安全、有效及合乎道德。報告在九大不同領(lǐng)域分別對人類基因編輯的管理和監(jiān)督提出了建議，包括人類基因編輯登記注冊；國際研究以及出于醫(yī)療目的的跨國旅行；非法、未注冊、不道德和不安全的研究；知識產(chǎn)權(quán)；以及教育、參與和賦權(quán)等。