新細(xì)菌“注射器”能破解基因治療遞送難題嗎？

3月29日，美國麻省理工學(xué)院—哈佛大學(xué)博德研究所張鋒團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志在線發(fā)表的論文中宣布，通過AlphaFold輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種新的蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)——改造、利用獨(dú)特的細(xì)菌“注射器”將蛋白質(zhì)注射到人類細(xì)胞中。

上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬教授表示，這項(xiàng)研究為蛋白質(zhì)精準(zhǔn)遞送技術(shù)的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了新方向，為將來在基因治療、癌癥治療、生物防治、核酸遞送等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。但相關(guān)應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究和開發(fā)。

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員吳宇軒認(rèn)為：“這一系統(tǒng)在細(xì)胞靶向特異性方面展現(xiàn)出的出色效果令人振奮，但其遞送效率仍有一定的提升空間，體內(nèi)遞送的長(zhǎng)期安全性也需要更多更具說服力的研究數(shù)據(jù)支撐。而針對(duì)遞送效率、特異性、安全性等的充分研究是臨床應(yīng)用前不可或缺的?！?/p>

精準(zhǔn)、靈活的細(xì)菌“注射器”

內(nèi)共生細(xì)菌是一類特殊的細(xì)菌，可以寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)部，它已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的遞送系統(tǒng)，使其能夠分泌調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生物因子。細(xì)胞外收縮注射系統(tǒng)（eCIS）就是一個(gè)例子，它是一種類似注射器的大分子復(fù)合物，可以通過在細(xì)胞膜表面誘導(dǎo)出一個(gè)刺突蛋白，從而將攜帶的蛋白質(zhì)有效載荷注入到真核細(xì)胞中。

張鋒團(tuán)隊(duì)選擇了來自生物發(fā)光細(xì)菌Photorhabdus asymbiotica的eCIS——PVC。PVC有效載荷蛋白的N端高度無序區(qū)域是其“包裝結(jié)構(gòu)域”，只要將其與想要遞送的蛋白融合，就能將其加載到PVC復(fù)合體中。隨后，他們利用預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的人工智能程序AlphaFold設(shè)計(jì)了修改尾部纖維蛋白的方法，使其能夠精準(zhǔn)地靶向人類細(xì)胞表面表達(dá)的不同蛋白。

通過對(duì)eCIS的進(jìn)一步改造，張鋒團(tuán)隊(duì)可以使用這一系統(tǒng)遞送不同類型的蛋白載荷，他們已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中成功遞送了CRISPR基因編輯系統(tǒng)中的Cas9蛋白，以及另一類用于基因編輯的鋅指蛋白。在小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，這種經(jīng)過改造的遞送系統(tǒng)也可以將蛋白遞送到小鼠大腦的神經(jīng)元中。

PVC遞送系統(tǒng)將有哪些應(yīng)用潛力？王皞鵬認(rèn)為，它可以應(yīng)用于基因治療、癌癥治療、生物防治和核酸遞送4個(gè)方面。“雖然作者沒有在文中成功實(shí)現(xiàn)核酸的遞送，但是目前有研究利用病毒肽構(gòu)建病毒樣顆粒實(shí)現(xiàn)核酸的遞送將病毒肽與DNA結(jié)合，然后將病毒肽包裹在PVC內(nèi)，可能也可以利用PVC系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)核酸遞送?！?/p>

具有高度靶標(biāo)特異性，但效率有待提升

吳宇軒的研究方向之一是通過CRISPR基因編輯治療以地中海貧血為主的血液疾病。他表示，張鋒團(tuán)隊(duì)研發(fā)的PVC遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出高度的靶標(biāo)特異性，能有效地將載荷遞送到擁有特定表面受體的細(xì)胞中。尤其是在人和小鼠細(xì)胞的靶向特異性測(cè)試中，展現(xiàn)了接近100%的靶向特異性。另一方面，該系統(tǒng)的靶向特異性可以通過對(duì)尾部纖維蛋白的合理改造來實(shí)現(xiàn)，這表明PVC展現(xiàn)出的高特異性是便于改造和拓展的，這給利用該系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞或組織特異性的體內(nèi)蛋白靶向遞送提供了廣闊的想象空間。

吳宇軒指出，這一遞送系統(tǒng)的遞送效率仍有待提升?！霸撗芯恐姓故镜幕赑VC的遞送系統(tǒng)進(jìn)行體外細(xì)胞系基因編輯的效率僅有12%左右，距離各種疾病使用基因編輯進(jìn)行治療的效率閾值仍有差距?！?/p>

另一方面，如果要將該遞送技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)，考慮到遞送損耗以及體內(nèi)細(xì)胞所處環(huán)境的復(fù)雜性，該遞送系統(tǒng)所產(chǎn)生的編輯效率可能會(huì)進(jìn)一步下降?！芭c目前常用的AAV載體相比，基于PVC的遞送系統(tǒng)顆粒大?。s116nm）相較于前者（約25nm）較大，和納米脂質(zhì)體顆粒（LNP，約60nm—200nm）大概相當(dāng)。過大的包裝體積，可能給體內(nèi)實(shí)質(zhì)組織中的深層細(xì)胞的高效率遞送造成一定的困難。并且，基于本項(xiàng)和前人關(guān)于PVC系統(tǒng)的研究，我們推測(cè)，該系統(tǒng)的包裝遞送效率可能也會(huì)受到載荷蛋白大小的影響，這可能是該遞送系統(tǒng)針對(duì)體外細(xì)胞的編輯效率過低的一個(gè)可能的原因。”

基因編輯知名科學(xué)家為何轉(zhuǎn)向遞送系統(tǒng)研究？

張鋒是基因編輯領(lǐng)域先驅(qū)科學(xué)家。2013年1月，張鋒團(tuán)隊(duì)首次將CRISPR基因編輯技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞。2013年年底，張鋒及其他4位基因編輯先驅(qū)科學(xué)家合伙創(chuàng)立了基因編輯公司Editas Medicine，創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)包括2020年因開發(fā)基因編輯技術(shù)而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的詹妮弗杜德納，以及堿基編輯先驅(qū)劉如謙。

2023年2月，張鋒聯(lián)合創(chuàng)建的新銳基因編輯公司Aera Therapeutics完成了近2億美元融資，將進(jìn)一步優(yōu)化根據(jù)其實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)的蛋白納米顆粒（PNP）遞送平臺(tái)技術(shù)。劉如謙的研究團(tuán)隊(duì)也正在開發(fā)基于病毒樣顆粒（virus-like particles, VLP）的遞送工具。此外，還有多家新銳公司專注于開發(fā)創(chuàng)新載體。

吳宇軒也注意到了張鋒和劉如謙的動(dòng)向。他認(rèn)為，兩位基因編輯領(lǐng)域的知名科學(xué)家轉(zhuǎn)向遞送系統(tǒng)研究的一個(gè)重要原因是，基因編輯藥物從體外的細(xì)胞治療往直接體內(nèi)治療過渡的過程中，對(duì)遞送載體提出了更高的要求，遞送載體成了體內(nèi)基因編輯藥物臨床應(yīng)用的關(guān)鍵限速步驟。

張鋒在接受《自然》采訪時(shí)表達(dá)了相似的觀點(diǎn)。他認(rèn)為，遞送系統(tǒng)的限制是基因編輯的主要瓶頸之一，大多數(shù)臨床試驗(yàn)只能編輯肝臟、眼睛或血細(xì)胞的基因組，因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)使用目前的遞送方法完成?！拔覀儧]有看到大腦或腎臟疾病得到解決，是因?yàn)闆]有良好的遞送系統(tǒng)?！?/p>