[科普中國]-小干擾RNA

小干擾RNA（Small interfering RNA；siRNA）有時稱為短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一個長20到25個核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達。此外，也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。不過這些復(fù)雜機制的反應(yīng)途徑目前尚未明了。

簡介小干擾RNA（siRNA），有時稱為短干擾RNA或沉默RNA，是一類雙鏈RNA分子，長度為20-25個堿基對，類似于miRNA，并且在RNA干擾（RNAi）途徑內(nèi)操作。它干擾了表達與互補的核苷酸序列的特定基因的轉(zhuǎn)錄后降解的mRNA，從而防止翻譯。

發(fā)現(xiàn)siRNA最早是由英國的大衛(wèi)·包孔博（David Baulcombe）團隊發(fā)現(xiàn)，是植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）現(xiàn)象的一部分，其研究結(jié)果發(fā)表于《科學(xué)》。2001年，湯瑪士·涂許爾（Thomas Tuschl）團隊發(fā)現(xiàn)合成的siRNA，可誘導(dǎo)哺乳動物體內(nèi)的RNAi作用，結(jié)果發(fā)表于《科學(xué)》。這項發(fā)現(xiàn)引發(fā)了利用可控制的RNAi，來進行生物醫(yī)學(xué)研究與藥物開發(fā)的方法。

結(jié)構(gòu)siRNA具有明確定義的結(jié)構(gòu)：具有磷酸化5'末端的短（通常20至24bp）雙鏈RNA（dsRNA）和具有兩個突出核苷酸的羥基化3'末端。該切酶酶催化生產(chǎn)的siRNA由長的dsRNA和小發(fā)夾RNA。siRNA也可以通過轉(zhuǎn)染引入細胞。由于原則上任何基因都可以被具有互補序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在后基因組時代驗證基因功能和藥物靶向的重要工具。

siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下：

每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羥基末端。此結(jié)構(gòu)是利用一種稱為dicer的酶處理而得，這種酶可以將較長的雙股RNA或小發(fā)夾RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用經(jīng)過適當(dāng)剪裁的siRNA之互補性，來對已知序列的基因進行標(biāo)定，這種現(xiàn)象使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項重要工具。

siRNA機制1.長dsRNA（可來自發(fā)夾，互補RNA和RNA依賴性RNA聚合酶）被稱為Dicer的內(nèi)切核糖核酸酶切割。Dicer切割長dsRNA以形成短干擾RNA或siRNA;這使得分子能夠形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。

2.一旦siRNA進入細胞，它就會被整合到其他蛋白質(zhì)中以形成RISC。

3.一旦siRNA是RISC復(fù)合物的一部分，siRNA就展開以形成單鏈siRNA。

4.由于其在5'末端的堿基配對而在熱力學(xué)上較不穩(wěn)定的鏈被選擇作為RISC復(fù)合物的一部分。

5.作為RISC復(fù)合物一部分的單鏈siRNA現(xiàn)在可以掃描并找到互補的mRNA

6.一旦單鏈siRNA（RISC復(fù)合物的一部分）與其靶mRNA結(jié)合，它就會誘導(dǎo)mRNA切割。

7.現(xiàn)在切割mRNA并被細胞識別為異常。這導(dǎo)致mRNA的降解，并且反過來不將mRNA翻譯成氨基酸然后轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。從而沉默編碼該mRNA的基因。

siRNA也類似于miRNA，然而，miRNA來自較短的莖環(huán)RNA產(chǎn)物，通常通過抑制翻譯來沉默基因，并且具有更廣泛的作用特異性，而siRNA通常通過在翻譯前切割mRNA而起作用，并且具有100%的互補性，因此目標(biāo)特異性非常嚴格。1

使用siRNA或其生物合成前體進行RNAi誘導(dǎo)通過轉(zhuǎn)染外源siRNA進行的基因敲低通常是不令人滿意的，因為該效應(yīng)僅是短暫的，特別是在快速分裂的細胞中。這可以通過產(chǎn)生siRNA的表達載體來克服。修飾siRNA序列以在兩條鏈之間引入短環(huán)。得到的轉(zhuǎn)錄物是短發(fā)夾RNA（shRNA），其可以通過Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的轉(zhuǎn)錄盒使用RNA聚合酶III啟動子（例如，U6或H1）來指導(dǎo)小核RNA（snRNA）的轉(zhuǎn)錄（U6參與基因剪接; H1是RNase）人RNase P）的成分。理論上，所得的siRNA轉(zhuǎn)錄物然后由Dicer處理。

通過使用細胞擠壓也可以提高基因敲低效率。

RNAi中siRNA的活性很大程度上取決于其與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）的結(jié)合能力。雙鏈體siRNA與RISC的結(jié)合之后是用內(nèi)切核酸酶解開和切割有義鏈。然后剩余的反義鏈-RISC復(fù)合物可以與靶mRNA結(jié)合以啟動轉(zhuǎn)錄沉默。

RNA激活已經(jīng)發(fā)現(xiàn)dsRNA還可以激活基因表達，這種機制被稱為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa。已經(jīng)顯示靶向基因啟動子的dsRNA誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。使用合成的dsRNA在人細胞中證明RNAa，稱為“小活化RNA”（saRNA）。目前尚不清楚RNAa是否在其他生物體中是保守的。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默siRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默始于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）的組裝。該復(fù)合物通過切割編碼靶基因的mRNA分子來沉默某些基因表達。為了開始該過程，兩條siRNA鏈中的一條（引導(dǎo)鏈）將被裝載到RISC中，而另一條鏈即過客鏈被降解。某些Dicer酶可能負責(zé)將引導(dǎo)鏈加載到RISC中。然后，siRNA掃描并指導(dǎo)RISC到mRNA分子上完全互補的序列。認為mRNA分子的切割由RISC的Argonaute蛋白的Piwi結(jié)構(gòu)域催化。然后通過切割與siRNA殘基10和11配對的靶核苷酸之間的磷酸二酯鍵精確切割mRNA分子，從5'端開始計數(shù)。這種切割導(dǎo)致mRNA片段被細胞核酸外切酶進一步降解。5'片段通過外來體從其3'末端降解，而3'片段從其5'末端通過5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。切割后靶mRNA鏈與RISC的解離允許更多的mRNA被沉默。這種解離過程很可能是由ATP水解驅(qū)動的外在因素促進的。

有時不會發(fā)生靶mRNA分子的切割。在一些情況下，磷酸二酯骨架的核酸內(nèi)切裂解可以通過切割位點附近的siRNA和靶mRNA的錯配來抑制。其他時候，即使靶mRNA和siRNA完全配對，RISC的Argonaute蛋白也缺乏內(nèi)切核酸酶活性。在這種情況下，基因表達將被miRNA誘導(dǎo)機制沉默。

Ping-Pong方法的簡化版本，涉及蛋白質(zhì)Aubergine（Aub）和Argonaute-3（Ago3）切割piRNA的3'和5'末端。

Piwi相互作用的RNA負責(zé)轉(zhuǎn)座子的沉默，而不是siRNAs。

挑戰(zhàn)：避免非特異性影響因為RNAi與許多其他途徑相交，所以偶爾通過實驗性引入siRNA觸發(fā)非特異性作用也就不足為奇了。當(dāng)哺乳動物細胞遇到諸如siRNA的雙鏈RNA時，它可能將其誤認為是病毒副產(chǎn)物并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。此外，由于結(jié)構(gòu)相關(guān)的微小RNA主要通過與靶mRNA的不完全互補堿基對相互作用調(diào)節(jié)基因表達，因此siRNA的引入可能導(dǎo)致非預(yù)期的脫靶。

先天免疫由于先天免疫應(yīng)答的激活，引入過多的siRNA可導(dǎo)致非特異性事件。迄今為止的大多數(shù)證據(jù)表明，這可能是由于dsRNA傳感器PKR的激活，盡管也可能涉及視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）。還描述了通過toll樣受體7（TLR7）誘導(dǎo)細胞因子。減少非特異性作用的一種有希望的方法是將siRNA轉(zhuǎn)化為microRNA。微小RNA天然存在，并且通過利用該內(nèi)源途徑，應(yīng)該可以在相對低濃度的所得siRNA中實現(xiàn)類似的基因敲低。這應(yīng)該最小化非特異性影響。

偏離目標(biāo)脫靶是使用siRNA作為基因敲低工具的另一個挑戰(zhàn)。在這里，具有不完全互補性的基因被siRNA無意中下調(diào)（實際上，siRNA充當(dāng)miRNA），導(dǎo)致數(shù)據(jù)解釋和潛在毒性的問題。然而，這可以通過設(shè)計適當(dāng)?shù)膶φ諏嶒瀬聿糠值亟鉀Q，并且目前正在開發(fā)siRNA設(shè)計算法以產(chǎn)生不具有脫靶的siRNA。然后可以使用例如通過微陣列技術(shù)的全基因組表達分析來驗證這一點并進一步改進算法。來自Khvorova博士實驗室的2006年論文涉及siRNA中與位置2向前的6或7個堿基對長的延伸，與脫靶基因中的3'UTR區(qū)域匹配。

適應(yīng)性免疫反應(yīng)純RNA可能是較差的免疫原，但很容易產(chǎn)生針對RNA-蛋白復(fù)合物的抗體。許多自身免疫疾病都會看到這些類型的抗體。目前還沒有關(guān)于針對蛋白質(zhì)結(jié)合的siRNA的抗體的報道。用于siRNA遞送的一些方法使聚乙二醇（PEG）與寡核苷酸鄰接，從而減少排泄并改善循環(huán)半衰期。然而，最近由于對RNA的PEG部分的嚴重過敏反應(yīng)，Regado Biosciences不得不停止針對因子IX的聚乙二醇化RNA適體的大型III期試驗。該反應(yīng)在某些情況下導(dǎo)致死亡，并且當(dāng)涉及PEG化寡核苷酸時引起對siRNA遞送的顯著關(guān)注。2

本詞條內(nèi)容貢獻者為:

成玉林 - 副教授 - 重慶大學(xué)