[科普中國(guó)]-米酵菌酸

米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的一種可以引起食物中毒的毒素。食入該毒素污染的食物可引起人或動(dòng)物中毒,重者可致死亡。米酵菌酸是發(fā)酵玉米面制品、變質(zhì)鮮銀耳及其它變質(zhì)淀粉類制品是引起中毒的主要原因。

簡(jiǎn)介米酵菌酸，化學(xué)名為：3-羧甲基-17-甲氧基-6，18，21-三甲基-廿二碳-2，4，8，12，14，18-七烯二酸。20世紀(jì)30年代國(guó)外從引起人中毒的椰子發(fā)酵食品樣品中提取出該毒素，并對(duì)該毒素的理化性質(zhì)和致毒機(jī)制進(jìn)行了大量研究，近年來米酵菌酸又作為研究抗腫瘤疾病和細(xì)胞凋亡的一種工具試劑來使用。我國(guó)70年代從酵米面中毒樣品中分離出一種稱為“酵米面黃桿菌”(Flavobacterium farinofermen-tans no sp)的食物中毒菌，其產(chǎn)生的外毒素-酵米面黃桿菌毒素A(簡(jiǎn)稱黃桿菌毒素A,flavotoxin A)現(xiàn)證明即為米酵菌酸1。

米酵菌酸的毒性BA作為酵米面中毒和銀耳中毒的病原菌產(chǎn)生的毒素之一,具有很強(qiáng)的生物活性,是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產(chǎn)物。臨床癥狀表現(xiàn)為惡心嘔吐、腹痛腹脹等,重者出現(xiàn)黃疸、腹水、皮下出血、驚厥、抽搐、血尿、血便等肝腦腎實(shí)質(zhì)性器官損害癥狀。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明,BA主要作用于肝、腦和腎等實(shí)質(zhì)性臟器且以細(xì)胞內(nèi)的線粒體最為敏感。國(guó)外有研究表明BA作用于胰腺β細(xì)胞抑制葡萄糖引起的電活性而造成高血糖,此后又可轉(zhuǎn)為低血糖,嚴(yán)重者出現(xiàn)低血糖昏迷。BA除對(duì)線粒體有破壞作用外,還可使部分巰基酶失活,因此解毒時(shí)可使用L-半胱氨酸等巰基化合物恢復(fù)由BA所抑制的巰基酶活性，減輕或解除BA的毒害。此外BA具有抑菌作用,對(duì)霉菌、酵母及某些細(xì)菌均有強(qiáng)烈的抑制和殺滅作用,12.5μg量的BA即可在平板上形成明顯的抑菌圈1。

米酵菌酸引起的食物中毒1. 污染的食物種類米酵菌酸是發(fā)酵玉米面制品、變質(zhì)鮮銀耳及其它變質(zhì)淀粉類制品是引起中毒的主要原因，常見的食品有糯米面湯圓、吊漿粑、小米或高粱米面制品、馬鈴薯粉條、甘薯淀粉等。椰毒假單胞菌酵米面亞種食物中毒多發(fā)生在夏、秋季節(jié)。潮濕、陰雨的天氣，再加上儲(chǔ)存不好，椰毒假單胞菌在食物中大量地生長(zhǎng)繁殖，吃了這種食物就會(huì)發(fā)生中毒。米酵菌酸耐熱，一般烹調(diào)方法不能破壞其毒性，但日曬兩日后可去除94%以上變質(zhì)銀耳中的毒素。

2. 中毒表現(xiàn)進(jìn)食后2~24小時(shí)出現(xiàn)上腹不適，惡心、嘔吐（嘔吐為胃內(nèi)容物，重者呈咖啡色樣物），輕微腹瀉、頭暈、全身無力等。重者可出現(xiàn)皮膚黃染、肝脾腫大、皮下出血、嘔血、血尿、少尿、意識(shí)不清、煩躁不安、驚厥、抽搐、休克等，體溫一般不升高，病死率高達(dá)40%~100%。

3. 急救措施立即手法或藥物催吐，催吐后口服活性炭，并盡快到醫(yī)院治療。凡與患者吃過同種食物的人，不論是否發(fā)病，一律送往醫(yī)院觀察、治療。

4. 中毒預(yù)防嚴(yán)禁用浸泡、霉變的玉米制作食品。家庭制備發(fā)酵谷類食品時(shí)要勤換水，保持衛(wèi)生，要保證食物無異味產(chǎn)生，最好的預(yù)防措施是不制作、不食用酵米面。禁止出售發(fā)霉變質(zhì)的鮮銀耳。學(xué)會(huì)正確辨別銀耳的質(zhì)量。正常干銀耳水泡發(fā)后，朵形完整、較大，菌片呈白色或微黃，彈性好，無異味；變質(zhì)銀耳不成形、發(fā)黏、無彈性，菌片呈深黃至黃褐色，有異臭味。發(fā)好的銀耳要充分漂洗，食用前要摘除銀耳的基底部。

米酵菌酸的中毒機(jī)制BA的毒性最早認(rèn)為是干擾糖代謝,以后人們一直研究其機(jī)制。1959年Welling等通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BA可抑制丙酮酸、α-酮戊二酸和蘋果酸的氧化,對(duì)磷酸化過程的抑制更為明顯。1970年Henderson以大鼠線粒體為材料證明了對(duì)氧化磷酸化的抑制部位不在呼吸鏈,而是線粒體膜上的ADP轉(zhuǎn)運(yùn)過程。Weidemann發(fā)現(xiàn)BA增加ADP與線粒體內(nèi)膜的親合力,阻斷ADP轉(zhuǎn)運(yùn)。Lauquin則證明BA在線粒體內(nèi)膜上與ADP載體形成復(fù)合物。于是吳洪娟等認(rèn)為由于BA與腺嘌呤載體ANT(電壓依賴性陰離子通道)的結(jié)合,成為ANT的特異性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，阻礙了ADP與ATP在線粒體內(nèi)膜的交換,使ATP生成減少或消失;由于缺乏ATP,細(xì)胞膜上的離子泵不能發(fā)揮正常功能而效率低下,引起細(xì)胞內(nèi)水鈉潴留,細(xì)胞水腫；線粒體內(nèi)膜依賴ATP的機(jī)制停止工作,造成水鈉潴留,從而引起線粒體腫脹,嵴變短、模糊直至消失。作為細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行呼吸作用和能量交換的重要場(chǎng)所及細(xì)胞內(nèi)主要的供能器官—線粒體,它的功能消失必將導(dǎo)致細(xì)胞、機(jī)體的死亡。1

食品中米酵菌酸的測(cè)定方法1. 國(guó)標(biāo)法GB 5009.189《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》2

（1）原理

試樣經(jīng)提取、凈化、濃縮及過濾后,經(jīng)高效液相色譜儀分析,外標(biāo)法定量。

（2）材料

固相萃取柱:陰離子交換柱(60mg/3mL)或等效品,臨用前依次加5.0mL甲醇和5.0mL水活化,保持柱體濕潤(rùn)。

米酵菌酸:純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.1mg/mL):準(zhǔn)確稱取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品1mg(精確至0.01mg),用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。置于2°C~8°C冰箱中避光保存,有效期為6個(gè)月。

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液:分別吸取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容,配制成米酵菌酸濃度分別為0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用時(shí)配制。

（4）分析步驟

A.固相萃取法：

提?。焊稍嚇咏?jīng)粉碎過φ0.425mm篩后,稱取20g(精確至0.01g)置于錐形瓶中,加入100mL甲醇-氨水溶液;鮮(濕)試樣經(jīng)剪碎、勻漿后稱取10g(精確至0.01g),加入80mL甲醇-氨水溶液?；靹?室溫下避光浸泡1h,置于超聲波振蕩器中超聲提取約30min,過濾。干試樣取濾液50mL,鮮(濕)試樣取濾液40mL。置80°C水浴中濃縮至約3mL,待凈化。

凈化：將濃縮后的試樣全部轉(zhuǎn)移到已活化的固相萃取柱中,依次用5mL水和5mL甲醇淋洗,棄去流出液,抽干萃取柱,再用6mL甲酸-甲醇溶液(2%)洗脫,收集洗脫液,于40°C±0.5°C水浴中氮吹至干,然后加入0.5mL甲醇,渦旋溶解,混勻,經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

B.液-液萃取法

提?。焊稍嚇咏?jīng)粉碎過φ0.425mm篩后,稱取20g(精確至0.01g),置于具塞錐形瓶中,加入20mL甲醇,室溫下避光浸泡1h,再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液(45.4%);鮮(濕)試樣經(jīng)剪碎、勻漿后稱取10g(精確至0.01g),加入16mL甲醇,于室溫下避光浸泡1h,再加入64mL三氯甲烷和0.16mL磷酸溶液(45.4%)。振蕩30min,過濾,干試樣取濾液50mL,鮮(濕)試樣取濾液40mL。

萃?。簩⑸鲜鰹V液分別移入150mL分液漏斗中,加入與濾液等體積的碳酸氫鈉溶液(40g/L),振搖2min,靜置待分層后,取出下層于另一分液漏斗中;再用碳酸氫鈉溶液(40g/L)10mL重復(fù)提取兩次,輕搖;將三次提取的碳酸氫鈉溶液合并,加入25mL三氯甲烷,振搖2min,靜置分層后棄去三氯甲烷,于分液漏斗中慢慢加入鹽酸溶液(6mol/L)調(diào)該溶液pH至2~3,加入石油醚50mL(鮮、濕試樣為40mL),振搖3min,靜置分層,取出石油醚層于旋蒸瓶中,再分別用石油醚30mL和20mL各提取一次(鮮、濕試樣兩次均為20mL),將石油醚層并入同一瓶中,于40°C±0.5°C水浴中旋蒸濃縮至干,用少量甲醇分次將旋蒸瓶中提取物溶解并轉(zhuǎn)移至5.0mL玻璃離心管或濃縮瓶中,于40°C±0.5°C下氮吹濃縮至干,然后加入0.5mL甲醇,渦旋溶解,混勻,經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

（5）色譜參考條件

色譜參考條件列出如下:
a) 色譜柱:C18色譜柱(柱長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒度5μm)或同等性能的色譜柱;b) 流動(dòng)相:甲醇+水=75+25,水用冰乙酸調(diào)pH 至2.5;
c) 流速:1.0mL/min;
d) 柱溫:30°C;
e) 檢測(cè)波長(zhǎng):267nm;
f) 進(jìn)樣量:20μL。

（6） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別將 20μL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜儀中,測(cè)定相應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖 A.1。5.4 試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液注入液相色譜儀中,以保留時(shí)間定性,同時(shí)記錄峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中米酵菌酸的濃度。

（7）分析結(jié)果的表述試樣中米酵菌酸含量按式(1)計(jì)算:

X=（ρ×V×2）/m..............................(1)

式中:
X ———試樣中米酵菌酸的含量,單位為微克每克(μg/g);

ρ ———由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中米醇菌酸的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);V ———試樣溶液的濃縮定容體積,單位為毫升(mL);
2 ———稀釋倍數(shù);

m ——— 試 樣 質(zhì) 量 ,單 位 為 克 (g)。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

（8）精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

（9）其他

方法檢出限為0.005μg/g,定量限為0.015μg/g。

2. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定銀耳中的米酵菌酸。樣品采用甲醇提取，混合強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱(PAX)凈化，UPLC BEH C(2.1×100 mm，1.7 μm)色譜柱分析，以 10 mmol/L 乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相，梯18度洗脫，串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，米酵菌酸在 1.6 μg/L~80 μg/L 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r)0.999 9，檢出限 0.5 μg/kg，加標(biāo)回收率 82 %~102 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD≤8.5 %。該方法快捷準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于銀耳中米酵菌酸的確證方法3。

3. 其他測(cè)定方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器結(jié)合固相萃取法等新型方法4。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

梁志宏 - 副教授 - 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)