[科普中國]-硝酸還原酶

硝酸還原酶的結(jié)構(gòu)

真核生物中已發(fā)現(xiàn)三種硝酸還原酶，高等植物中最常見的一種是NADH-specific硝酸還原酶(EC1．6．6．1)。在少數(shù)幾種植物中發(fā)現(xiàn)了第二種，即NAD(P)H-bispecific硝酸還原酶(EC1．6．6．2)，它在歐洲白樺中以同源異構(gòu)體式存在，在大豆和單子葉植物(玉米、水稻和大麥等)中以第二種同源異構(gòu)體形式和NADH-specific硝酸還原酶一起存在。第三種形式為NADPH-specific(EC1．6．6．3)，存在于真菌和苔蘚中。

硝酸還原酶是同源二聚體，每個(gè)亞基分子質(zhì)量約100～110kDa，包含三個(gè)功能區(qū)，從N-末端到C-末端分別是:鉬輔酶MoCo(硝酸鹽結(jié)合與降解區(qū)域)，血紅素-Fe(細(xì)胞色素b5結(jié)合域)和FAD(黃素腺苷酸二核苷酸磷酸、細(xì)胞色素b還原酶、NADH或NADPH結(jié)合域)。這三個(gè)區(qū)域是氧化還原中心，催化電子從NADP或NADPH轉(zhuǎn)移到硝酸鹽上。這三個(gè)結(jié)構(gòu)和功能域通過hingeⅠ和hingeⅡ兩個(gè)鉸鏈連接起來。植物體內(nèi)，hingeⅠ連接細(xì)胞色素b5結(jié)合域和鉬輔酶/二聚化區(qū)域，它包含一個(gè)保守的磷酸化絲氨酸殘基，被具有調(diào)控作用的14-3-3二聚體識別，在植物、真菌和哺乳動物細(xì)胞中這個(gè)二聚體來自一個(gè)高度保守的基因家族。在二價(jià)陽離子存在的情況下，hingeⅠ把硝酸還原酶轉(zhuǎn)換成完全無活性的復(fù)合體，使之不能行使從NADPH到硝酸鹽之間的電子轉(zhuǎn)移，從而抑制酶的活性。

硝酸還原酶代謝途徑硝酸鹽被特異性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(硝酸還原酶T)高效運(yùn)輸?shù)街参锔?xì)胞中，儲存在液泡里，在細(xì)胞質(zhì)中被硝酸還原酶降解成亞硝酸鹽。亞硝酸鹽進(jìn)入根的葉綠體或非綠色組織的質(zhì)體中，在6-鐵氧還蛋白的幫助下亞硝酸還原酶將其進(jìn)一步還原成銨。細(xì)胞中發(fā)生的從硝酸鹽到銨的降解過程分為兩步，第一步是硝酸還原酶將硝酸鹽降解成亞硝酸鹽;第二步為亞硝酸還原酶將亞硝酸鹽降解成銨。隨后在ATP供能下，谷氨酰胺合成酶(GS)將谷氨酸和NH+4轉(zhuǎn)換成谷氨酰胺，該過程是在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)或根細(xì)胞質(zhì)體中進(jìn)行的，最終銨參與到氨基酸的合成。谷氨酸合成酶(GOGAT)可將谷氨酰胺和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)換為兩分子的谷氨酸。谷氨酸合成酶有NADH-GOGAT和Fd-GOGAT兩種類型，前者主要存在于高等植物的光合細(xì)胞中，以NADH為電子供體，活性較高;后者在高等植物光合細(xì)胞和非光合細(xì)胞中均存在，以還原態(tài)的鐵氧還蛋白為電子供體，活性較低。

此外，當(dāng)植物細(xì)胞中NH+4濃度較高時(shí)，NADH提供電子，NH+4還可以由存在于葉綠體和線粒體中的谷氨酸脫氫酶還原為谷氨酸。但谷氨酸脫氫酶與NH+4的親和度較低。有些氨基酸是在轉(zhuǎn)氨酶的參與下由谷氨酸和酮酸參與形成的。氨基酸構(gòu)成蛋白質(zhì)和各種含氮化合物，也是次生化合物的起點(diǎn)。這里的所有酶和反應(yīng)被稱為硝酸鹽同化途徑。

硝酸還原酶、亞硝酸還原酶與N-亞硝胺的聯(lián)系

植物體內(nèi)的硝酸鹽在硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的作用下，通過代謝途徑轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，再轉(zhuǎn)化為銨，最后被用于蛋白質(zhì)的合成。土壤中硝酸鹽含量過高時(shí)，植物體內(nèi)的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶不發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累。亞硝酸鹽是在葉片褐變和莖形成過程中產(chǎn)生的。亞硝酸鹽是亞硝基化劑的前體，亞硝基化劑與煙草生物堿反應(yīng)生成煙草特有亞硝胺(N-亞硝胺)。硝酸鹽同化途徑第二步中，亞硝酸還原酶催化亞硝酸鹽還原成銨，因此，NO－3到NO－2再到NH+4的過程會因N-亞硝胺的積累而受限。通過修飾氮同化途徑來控制亞硝酸還原酶活性，可影響細(xì)胞中亞硝酸鹽的建成1。

硝酸還原酶的表達(dá)植物硝酸還原酶受到很多環(huán)境因子調(diào)節(jié)，如氮源、光、O2/CO2、pH和溫度，還有些內(nèi)在因素如代謝物和植物激素。研究發(fā)現(xiàn)，將硝酸還原酶基因連接在CaMV35S啟動子下構(gòu)成組成型表達(dá)轉(zhuǎn)入煙草中，光照或者56h黑暗處理后，轉(zhuǎn)基因煙草硝酸還原酶mRNA水平高達(dá)野生型的5倍，硝酸還原酶蛋白積累，硝酸還原酶活性被激活。這些轉(zhuǎn)基因植物葉片中硝酸鹽的含量降低，但生長和代謝未受到明顯影響。類似結(jié)果顯示，硝酸還原酶或亞硝酸還原酶基因的過表達(dá)可提高mRNA水平，也提高了植物對氮的吸收，但硝酸還原酶和亞硝酸還原酶參與調(diào)控并沒有促進(jìn)植物生長或提高產(chǎn)量。通常，硝酸鹽降解能力和植物生長之間沒有直接聯(lián)系，比如硝酸還原酶活性低的植物與野生型植株并無顯著差異，但當(dāng)硝酸還原酶活性比野生型低10%時(shí)，生長就受到影響。Hnsch等證明，轉(zhuǎn)基因植物根部硝酸還原酶活性的喪失改變了其體內(nèi)糖類和被降解的含氮物的分布，與野生型相比生長延緩。過表達(dá)硝酸還原酶的轉(zhuǎn)基因煙草，吸收硝酸鹽的速率比野生型慢，證明了谷氨酸或其他氨基酸的大量存在。Lea等研究表明，硝酸還原酶基因的翻譯后調(diào)控可強(qiáng)烈影響游離氨基酸和硝酸鹽的含量。一般情況下，硝酸還原酶的反常轉(zhuǎn)錄對代謝沒有太大影響，但在翻譯后水平，相關(guān)代謝產(chǎn)生了明顯的變化。硝酸還原酶的組成型表達(dá)暫時(shí)推遲了干旱引起的硝酸還原酶活性的喪失，由此CaMV35S啟動子趨動下的硝酸還原酶的表達(dá)可能促進(jìn)短期缺水后氮同化獲得更快的恢復(fù)2。