[科普中國]-重折疊

【分類】有些蛋白，尤其是小分子的肽類，很容易復(fù)性，例如高表達(dá)干擾素、腫瘤壞死因子等用強變性劑鹽酸胍破菌溶解，稀釋后去除變性劑，就能表現(xiàn)出良好活性。而大分子蛋白以及二硫鍵較多的分子，重折疊就較困難，有的根本就難以復(fù)性。例如高表達(dá)的Era蛋白，用尿素溶解后，在其底物GDP(鳥苷二磷酸)存在下，極緩慢地降低尿素濃度，最后去除尿素，也只有半數(shù)Era可復(fù)性溶解。由此可見蛋白質(zhì)的復(fù)性或重折疊是一個十分復(fù)雜的過程，而它又是應(yīng)用生化工程技術(shù)的關(guān)鍵，所以有許多學(xué)者對多肽鏈?zhǔn)侨绾握郫B形成具有生物活性蛋白質(zhì)的過程進(jìn)行了艱苦的研究。

【重折疊途徑】蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)和動力學(xué)控制用熱力學(xué)和動力學(xué)分析的方法，對重折疊途徑的步驟進(jìn)行研究，其目的在于“活化”宿主微生物系統(tǒng)表達(dá)的無活性重組蛋白。為此先要闡釋或假設(shè)存在于蛋白質(zhì)的初級結(jié)構(gòu)，以初步確定折疊途徑的折疊密碼。如果能破譯折疊密碼，就可以用DNA順序?qū)Φ鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并通過重組DNA技術(shù)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子改造，從而確定某一給定氨基酸順序的生物學(xué)功能。

①經(jīng)典的“熱力學(xué)假說”——變性重折疊過程中熱力學(xué)上的可逆性。

②變性一重折疊過程中熱力學(xué)上的競爭性。隨著對蛋白折疊研究的廣泛開展，發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)在體外的變性一重折疊過程并非完全可逆1

【重折疊方法的選擇】

在絕大多數(shù)情況下．溶解變性的異源蛋向完全喪失了空間構(gòu)象。如果異源蛋白在溶解變性過程中并不是100%的處于非折疊狀態(tài)，或者還原型的蛋白質(zhì)是可溶性的(如腫瘤壞死因子TNF)，則下游操作可簡單地包括離心、緩沖液交換、二硫鍵氧化，必要時進(jìn)行層析純化。如果異源蛋白是完全變性的，則必須進(jìn)行重折疊操作，并盡可能避免部分折疊中間產(chǎn)物形成不溶性集聚物。為達(dá)到此目的可采取下列方法：

(1)一步稀釋法

蛋白質(zhì)集聚作用屬于多級動力學(xué)反應(yīng)，嚴(yán)格依賴于蛋白質(zhì)的濃度。在稀釋過程中，重折疊與集聚作用的相互競爭可用數(shù)學(xué)模型關(guān)聯(lián)，而且重折疊蛋向質(zhì)的回收率可由兩個反應(yīng)的速度常數(shù)推算。硅然，在重折疊操作中，降低蛋白質(zhì)濃度可以在很大程度上抑制集聚作用。例如，牛生長激素在重折疊反應(yīng)中的濃度為1．6 mg/mI。時，可以觀察到部分折疊中間產(chǎn)物的形成，但在稀釋100倍后，折疊中間產(chǎn)物便不會大量形成，這種濃度恰恰是牛生長激素體外折疊的最佳條件。然而，重折疊反應(yīng)液高倍數(shù)的稀釋不僅增加了復(fù)性緩沖液的消耗成本，而且也為后續(xù)純化T序帶來了很大麻煩。應(yīng)當(dāng)指出的是。蛋白質(zhì)性質(zhì)不同，其最佳重折疊所對應(yīng)的蛋白濃度差別很大．有些蛋白質(zhì)可在0．1～10 mg/mL的濃度內(nèi)溶解完全，并足以進(jìn)行有效折疊。

(2)分段稀釋法

對于那些非折疊和部分折疊狀態(tài)不溶于水的蛋白質(zhì)，往往采用分步稀釋的方法對之進(jìn)行有效復(fù)性。變性蛋白在啟動體外復(fù)性和重折疊時，不但變性劑的性質(zhì)和濃度對折疊率有很大影響，而且對其變化速度的掌握也至為重要，也就是說，變性劑的更換或稀釋速度快慢對重折疊的影響因蛋I上I質(zhì)而異。稀釋速度加快有利于重折疊的典型例子是色氨酸酶，它在3 mol/L的尿素溶液中極易形成部分折疊中間產(chǎn)物的集聚作用，因此從8 mol/L尿素的變性溶液透析至低濃度時，必須加快透析速度．使得色氨酸酶在3 mol/l，尿素溶液中的存在時間盡可能最短。反之．若將含有牛生長激素的2．8～5 mol/l。鹽酸胍溶液迅速稀釋到復(fù)性重折疊所需的低濃度，會使產(chǎn)物大量的不可逆沉淀，但若將這個溶液先稀釋至2 mol/I。鹽酸胍濃度，并保溫一段時間，此時難溶性的折疊中間產(chǎn)物逐步趨于溶解，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步的稀釋則可獲得高產(chǎn)率的天然蛋向。應(yīng)當(dāng)特別指出的是，在上述分段稀釋法中，重折疊蛋白的產(chǎn)率還與蛋白質(zhì)濃度密切相關(guān)．所采用的稀釋倍數(shù)也受到緩沖液pH、離子組成及保溫溫度的顯著影響。與天然折疊蛋白的等電點沉淀性質(zhì)相似，在重折疊過程中應(yīng)當(dāng)避免折疊緩沖液的pH接近重組異源蛋白質(zhì)的等電點pl。除此之外，還應(yīng)注意選擇緩沖液的離子種類及使用濃度。由于陰離子對蛋白質(zhì)疏水作用強度產(chǎn)生性質(zhì)不同的影響，它們同時兼有穩(wěn)定蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)以及誘導(dǎo)折疊蛋白集聚的雙重功能。各種陰離子的作用強度次序為：Soj一>HPo；>Ac>Ci”>C12>N03一>T一：>Cl()1：>SCN(其中Ci=卜為檸檬酸根)，其中多價陰離子的雙重功能一般比單價陰離子要強。

(3)特種試劑添加法

在復(fù)性折疊系統(tǒng)巾，某些特殊化合物的存在可以提高很多蛋白質(zhì)的重折疊率。例如，0．2mol/L的精氨酸可以明顯改善重組人尿激酶原(pro-UK)的活性回收率，同樣條件也適用于組織型血纖維蛋白溶酶原(t—PA)以及免疫球蛋白片段的體外重折疊。0．1 mol/I．的甘氨酸能提高松弛肽激素的折疊產(chǎn)率，而血紅素和鈣離子則能促進(jìn)重組馬過氧化酶的重折疊反應(yīng)。另外，有些中性分子如甘油、蔗糖、聚乙二醇等，也能穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，在某些情況下，將這些中性物質(zhì)加入折疊緩沖液中，可以改善蛋白質(zhì)的體外重折疊產(chǎn)率。

(4)蛋白化學(xué)修飾法

胰蛋白酶原的重折疊很難用上述的緩沖液交換方法實現(xiàn)，然而在變性條件下，若將這個蛋白質(zhì)的游離巰基特異性保護(hù)，然后再將蛋白分子進(jìn)行檸檬酸酐酰化修飾，則修飾后的胰蛋白酶原可溶于非變性的緩沖液中，從而促進(jìn)重折疊反應(yīng)的順利進(jìn)行。在上述修飾反應(yīng)中所使用的酸酐活性試劑能可逆性地修飾多肽鏈上的游離氨基，并將其正電荷轉(zhuǎn)換成負(fù)電荷，從而使蛋白質(zhì)形成多聚陰離子狀態(tài)，后者通過分子問的斥力阻止集聚作用的發(fā)生。一旦修飾蛋白氧化并轉(zhuǎn)人非變性溶液中，將pH調(diào)低至5．0，即可通過脫酰基反應(yīng)回收具有天然折疊構(gòu)象的蛋白產(chǎn)物。這一方法的效果已為后來的多次實驗所證實，特別適用于包涵體型重組蛋白的活性回收。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾也可用于防止因二硫鍵錯配所產(chǎn)生的共價集聚作用。在變性溶解狀態(tài)下，將多肽鏈上的所有游離巰基全部烷基化封閉，然后進(jìn)行復(fù)性重折疊操作，最終脫去烷基并在氧化條件下修復(fù)二硫鍵。

(5)重折疊分子隔離法

蛋白質(zhì)及其折疊中間產(chǎn)物的集聚作用依賴于分子之間的碰撞與接觸，因此將非折疊蛋白分子固定化，從理論上來說可以從根本上杜絕集聚作用的產(chǎn)生，實驗結(jié)果也證明這一思路的實用價值。例如，將非折疊狀態(tài)的胰蛋白酶原固定在瓊脂糖球狀顆粒上，然后用一種復(fù)性緩沖液平衡層析柱，即可回收71%的酶活性。如果固定在層析介質(zhì)上的蛋白質(zhì)能方便地可逆性回收，那么就可實現(xiàn)蛋白原位重折疊，最終通過特定的解離溶劑從重折疊層析柱上洗脫天然構(gòu)象的活性蛋白產(chǎn)物。這項技術(shù)已被成功地用于包涵體型重組蛋白的重折疊，只是精細(xì)的操作條件尤其是層析介質(zhì)對蛋白質(zhì)的親和性尚有待于逐一建立。2