[科普中國]-羰基二咪唑法

人工抗原制備方法

根據(jù)免疫學的原理，好的抗原能夠刺激機體產(chǎn)生特異性高的抗體。但是作為小分子物質(zhì)，其分子質(zhì)量一般低于1000，很難像大分子蛋白質(zhì)那樣有效激活機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體。因此小分子物質(zhì)只具有產(chǎn)生免疫反應(yīng)性，但缺乏免疫原性，將這種小分子物質(zhì)稱之為半抗原。但是大分子蛋白質(zhì)，例如常用的偶聯(lián)載體BSA、OVA、KLH、HAS等，這些蛋白質(zhì)分子質(zhì)量都大于30kD，當把半抗原通過適當?shù)呐悸?lián)方法連接到這些載體蛋白上，然后用這些載體蛋白和小分子的偶聯(lián)物進行免疫時，免疫動物就會有效的產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生針對小分子半抗原的抗體。另外，在檢測的時候，小分子物質(zhì)也不能有效的被固相載體吸附，因此也必須通過偶聯(lián)載體的形式吸附與固相載體上，便于檢測1。

目前，人工制備小分子完全抗原的方法很多，具體采用哪種方法進行偶聯(lián)，還需要根據(jù)小分子物質(zhì)自身的分子結(jié)構(gòu)，以及偶聯(lián)載體所具有的活性基團來進行制備?，F(xiàn)在偶聯(lián)方法主要包括：混合酸酐法、戊二酸酐法、戊二醛法、碳二亞胺法、活潑酯法、羧甲基羥胺法、過碘酸氧化法、1,4-丁二醚法、對氨基苯甲酸法等。其中混合酸酐法經(jīng)常被用于那些含有游離羧基的小分子半抗原與載體蛋白上游離的氨基，碳二亞胺法主要適用于含有氨基的小分子物質(zhì)與所及化合物的偶聯(lián)，重氮化法主要用于小分子苯環(huán)上含有氨基的偶聯(lián)，過碘酸氧化法主要用于一些小分子物質(zhì)中含有糖環(huán)化的偶聯(lián)，羧甲基羥胺法主要用于小分子含有的酮基的偶聯(lián)，活潑酯法是直接將N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）作為活化劑，以環(huán)二己基碳酰亞胺（DCC）為脫水機不經(jīng)過偶聯(lián)橋直接將小分子物質(zhì)連接到載體蛋白上，這種方法也被證明產(chǎn)生副產(chǎn)物少和抗體特異性強。

小分子上與蛋白連接基團的選擇對所產(chǎn)生抗體的特異性的影響小分子為具有多種反應(yīng)基團如氨基、羧基、醛基等的物質(zhì)，這些基團既是其區(qū)別于與其相近似分子的特異性抗原決定簇之所在，也是其用于與蛋白分子的交聯(lián)的結(jié)合基團。因此，當這些基團與蛋白大分子結(jié)合后，再免疫動物所得到的抗體，往往特異性會有所降低，尤其是分子結(jié)構(gòu)上相近似的小分子，如選用每種小分子物質(zhì)特有基團連接蛋白，則免疫動物后所得抗體的特異性就差，因為其特異的抗原決定簇在刺激動物機體抗體的生成中不起作用，而共同的基團所組成的抗原決定簇卻不受影響，激發(fā)機體的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生能結(jié)合具有此決定簇的所有近似小分子的抗體。因此，選擇相關(guān)小分子均有基團用于與蛋白分子的交聯(lián)，得到的抗體具有較好的特異性。此外，在小分子與載體蛋白之間加入一連接空間臂，也能改善所得抗體的特異性。

N'N-羰基二咪唑法制備RAC人工抗原利用N'N-羰基二咪唑?qū)⑷R克多巴胺（RAC，Ractopamine））上的羥基直接與載體蛋白上的羧基偶聯(lián)制備RAC人工抗原，通過鑒定結(jié)果可以看出此方法初步可行。N'N-羰基二咪唑法制備人工抗原的過程中，由于偶聯(lián)形成的是酯鍵，不如肽鍵穩(wěn)定，因此抗原的穩(wěn)定性和溶劑對抗原制備效果的影響還需要進一步研究。

制備方法①在干燥條件下用萬分之一分析天平稱取17mg（約50μmol）RAC，溶于2.5mL分析純的四氫呋喃溶液或無水吡啶溶液，使其充分溶解。

②加入20mgCDI，于37℃條件下120r/min攪拌反應(yīng)1小時，然后用氮氣吹干四氫呋喃。

③在干燥條件下稱取25mgBSA，溶于3mLpH7.2的PBS緩沖溶液中，使其充分溶解。

④將步驟2得到的產(chǎn)物用300μLDMF充分溶解后逐滴加入到配好的BSA溶液中，在室溫條件下攪拌反應(yīng)4小時，轉(zhuǎn)速為120r/min。

⑤收集反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移到處理好的透析袋中，然后放入PBS緩沖液中，4℃條件下透析3天，每經(jīng)過6-8個小時用預冷的新鮮PBS進行換液。

⑥透析結(jié)束后，收集透析后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入離心管中，5000r/min條件下離心10分鐘，收集上清，分裝后于-20℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

抗原的鑒定對N'N-羰基二咪唑法制備的RAC人工抗原分別進行濃度測定、紫外光譜掃描鑒定、SDS-PAGE凝膠電泳鑒定和免疫原性鑒定。

抗原鑒定結(jié)果紫外光譜掃描鑒定結(jié)果

載體蛋白BSA在279nm有最大吸收峰，RAC在274nm處有最大吸收峰。采用N'N-羰基二咪唑法制備RAC-BSA人工抗原的最大吸收峰在278nm處，較載體BSA的最大吸收峰279nm有藍移現(xiàn)象，與相關(guān)文獻報道一致，可以說明通過N'N-羰基二咪唑法能夠?qū)AC與載體蛋白偶聯(lián)，從而制備RAC的人工抗原。

SDS-PAGE鑒定結(jié)果

根據(jù)BSA的分子質(zhì)量，其條帶出現(xiàn)在65kD處，而人工抗原RAC-BSA與載體蛋白BSA相比，由于載體BSA上偶聯(lián)有RAC分子，分子質(zhì)量有所增加，出現(xiàn)滯后現(xiàn)象，與混合酸酐法相比，兩種方法制備的抗原都出現(xiàn)了不同程度的拖尾現(xiàn)象，再次證明通過N'N-羰基二咪唑法可以將載體BSA與RAC分子進行偶聯(lián)。

效價測定結(jié)果

從效價結(jié)果可知，當把N'N-羰基二咪唑法制備的RAC-BSA作為免疫原免疫Balb/c小鼠，把Linker法制備的RAC-OVA作為包被原用于ELISA檢測小鼠血清效價，免疫兩只小鼠效價平均值測得小鼠的效價達到1：6400，從效價結(jié)果可知，N'N-羰基二咪唑法制備的RAC-BSA產(chǎn)生抗血清效價較1,4-丁二醚法和混合酸酐法低，原因可能是CDI法制備RAC人工抗原過程中偶聯(lián)效率不高造成的2。