[科普中國]-色氨酸籠

蛋白質(zhì)折疊

在生物體系中，蛋白質(zhì)折疊是最重要和最具有挑戰(zhàn)性的問題。隨著計(jì)算能力的增強(qiáng)，用全原子分子動力學(xué)模擬研究蛋白質(zhì)折疊對人們來講已經(jīng)非常普遍。原則上來講，直接的分子動力學(xué)模擬能夠提供蛋白質(zhì)folding/unfolding的熱動力學(xué)信息，但是直接的計(jì)算經(jīng)常受到勢能面上相空間取樣效率問題的阻礙。為了獲得蛋白質(zhì)構(gòu)型空間上完全取樣，發(fā)展了廣義系統(tǒng)算法包括多重正則算，模擬退火算法和副本交換分子動力學(xué)（REMD）方法。在那些方法中，REMD方法是模擬蛋白質(zhì)折疊最流行的方法之一。

色氨酸籠設(shè)計(jì)具有20個殘基的小蛋白Trp-cage（色氨酸籠），由于它非常小并且很容易折疊，使它成為架起理論和實(shí)驗(yàn)橋梁的理想的模型。Trp-cage(TC5B：NLYIQWLKDGGPSSGRPPS;PDBentry1L2Y)是由Neidigh等人設(shè)計(jì)，包括α-螺旋（殘基2-8）310–螺旋（殘基11-14）多聚脯氨酸II螺旋（殘基17-19）。TC5B中疏水核（兩個脯氨酸和3號絡(luò)氨酸）被認(rèn)為是形成折疊的主要驅(qū)動力。折疊結(jié)構(gòu)被在9號天門冬氨酸和16號精氨酸形成的鹽橋進(jìn)一步穩(wěn)定。

Simmerling等人用AMBER99力場和普適的波恩溶劑模型（GB）研究發(fā)現(xiàn)在20ns到50ns的動力學(xué)模擬中，有一個結(jié)構(gòu)非?？拷麼MR結(jié)構(gòu)，重原子的RMSD是1.4?。Snow等人用OPLS分子力場和GB/SA溶劑模型研究TC5B的折疊比率并且提出了折疊時(shí)間范圍從1.5μs到8.7μs。Duan等人用AMBER99分子力場和GB模型研究TC5B的快速折疊機(jī)理。從線狀結(jié)構(gòu)出發(fā)，他們模擬出最終結(jié)構(gòu)的主鏈原子與NMR結(jié)構(gòu)主鏈原子的RMSD在1.0?以內(nèi)。Chen等人用CHARMM22/CMAP全原子分子力場和GBSW隱式溶劑模型成功折疊了TC5B。

盡管TC5B的NMR結(jié)構(gòu)已經(jīng)被各種各樣的計(jì)算模擬正確預(yù)測，但是對TC5B的folding/unfolding的動力學(xué)行為的理論模擬并沒有正確的結(jié)論。Pitera等人用AMBER94分子力場和GB/SA溶劑模型進(jìn)行REMD模擬來研究TC5B的折疊行為，他們計(jì)算的熔解溫度大約400K，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)值315K。Zhou等人用OPLA-AA分子力場和顯式溶劑模型來進(jìn)行REMD模擬并且發(fā)現(xiàn)熔解溫度在440K左右。Paschek等人發(fā)現(xiàn)折疊的TC5B是太穩(wěn)定，熔解溫度高出實(shí)驗(yàn)值130K。上述那些結(jié)果，在不同的分子力場和不同的溶劑模型下，都顯示了比實(shí)驗(yàn)值更高的熔解溫度。注意上述的那些結(jié)果經(jīng)常依靠分子力場以及所應(yīng)用的溶劑模型。Shell等人最近研究表明：蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對所用的分子力場和的溶劑模型是非常敏感的1。

色氨酸籠折疊形成機(jī)制的研究進(jìn)展色氨酸籠的折疊過渡溫度目前國內(nèi)外科研工作者通過核磁共振(NMR)、圓二色(CD)光譜、熒光猝滅光譜(FQCTS)、紫外共振拉曼光譜(URRS)等實(shí)驗(yàn)手段對色氨酸籠的折疊機(jī)制都已進(jìn)行過深入的研究，結(jié)果表明其折疊過程可在1.0-4.1μs范圍內(nèi)完成，該結(jié)果也得到了理論模擬計(jì)算的驗(yàn)證。然而，目前對于色氨酸籠的一些具體的折疊細(xì)節(jié)過程仍然存在很大爭議和疑問。例如Qiu等通過跳溫波譜技術(shù)(TJS)研究表明色氨酸籠通過兩態(tài)協(xié)同的方式完成折疊過程；但Neuweiler和Ahmed課題組發(fā)現(xiàn)色氨酸籠并非只是一個簡單的兩態(tài)折疊蛋白；還有一些課題組利用分子動力學(xué)模擬方法對Trp-cage的折疊路徑和機(jī)理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：Trp-cage折疊轉(zhuǎn)變過程中過渡態(tài)形成的溫度約為400K或更高溫度，未能重復(fù)得出實(shí)驗(yàn)所得到的過渡態(tài)的溫度(315K)；而Day、Duan和Zhang等對Trp-cage折疊過程進(jìn)行的副本交換分子動力學(xué)(REMD)模擬發(fā)現(xiàn)，溶解溫度可以和實(shí)驗(yàn)值相吻合。通過分析比較可以推測，這些模擬計(jì)算結(jié)果的差異性主要是由于動力學(xué)模擬所采用分子力場與溶劑模型的不同?；谶@種模擬計(jì)算和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的不一致，最近O-dziej等采用二維核磁共振技術(shù)與分子動力學(xué)模擬相結(jié)合的方法對Trp-cage的折疊過渡溫度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：由于色氨酸籠折疊復(fù)雜性(關(guān)鍵氨基酸Trp6和Pro12的疏水長程協(xié)同作用與N端α-helix解旋過程同時(shí)發(fā)生)，其折疊過渡溫度并非在某一溫度時(shí)刻，而是在311-317K范圍內(nèi)。

色氨酸籠的折疊形成機(jī)制目前對于色氨酸籠折疊過程中各個折疊細(xì)節(jié)發(fā)生的順序一直都未達(dá)成共識。例如國內(nèi)外一些研究蛋白折疊課題組發(fā)現(xiàn)鹽橋Asp9/Arg16的率先形成對色氨酸籠的折疊發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而這恰恰與實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果相反。通過圓二色譜實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，將鹽橋Asp9/Arg16去掉后，色氨酸籠的折疊時(shí)間未發(fā)生明顯的變化，并且最近研究也發(fā)現(xiàn)模擬計(jì)算起始構(gòu)象中的鹽橋Asp9/Arg16甚至并不能穩(wěn)定存在，在模擬過程中會發(fā)生斷裂消失，并且N端α-helix的穩(wěn)定存在與其形成具有緊密聯(lián)系。Chowdhury和Hu等運(yùn)用全原子分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)疏水核心Trp6的包埋掩藏是色氨酸籠折疊過程的關(guān)鍵限速步驟，而Juraszek等采用副本交換分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)Trp-cage折疊過程的限速步驟并非絕對為疏水核心吲哚環(huán)的包埋，其研究結(jié)果表明色氨酸籠N-端上的α-螺旋結(jié)構(gòu)形成于折疊過程的早期，之后疏水殘基逐漸向疏水核心(Trp6)靠攏，最終疏水核中的Trp6側(cè)鏈上的吲哚環(huán)完整包埋而結(jié)束整個折疊過程。Mok等通過脈沖光譜實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在非折疊態(tài)結(jié)構(gòu)的Trp-cage中存在疏水核結(jié)構(gòu)，說明疏水核的塌陷推動蛋白結(jié)構(gòu)的整個折疊進(jìn)程，即所謂的疏水塌陷模型。Trp-cage這種疏水塌陷折疊模型的提出也得到了其他課題組的支持，而Ahmed課題組發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中N端的α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成先于疏水核的塌陷，Juraszek課題組卻認(rèn)為Trp-cage的折疊形成遵循成核-聚集和擴(kuò)散-碰撞模型?？梢?，雖然色氨酸籠只有20個氨基酸組成，且其結(jié)構(gòu)簡單緊湊且折疊迅速，但其折疊機(jī)制仍然存在爭議。為了探究該色氨酸籠復(fù)雜的折疊過程，我們曾采用溫控分子動力學(xué)(TCMD)方法對色氨酸籠在真空和水溶劑條件下的折疊與解折疊過程進(jìn)行了深入的研究，得到了Trp-cage折疊過程中的重要中間態(tài)結(jié)構(gòu)，為其折疊與解折疊機(jī)制的揭示提供了直接、可靠的依據(jù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶劑水分子可通過疏水作用誘導(dǎo)Trp-cage形成一個亞穩(wěn)態(tài)(MSOL)和一個非天然態(tài)疏水核的過渡態(tài)(TS)結(jié)構(gòu)，推動肽鏈?zhǔn)杷畾埢g的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)肽鏈結(jié)構(gòu)疏水核的快速收縮和正確折疊。為深入理解Trp-cage天然折疊態(tài)構(gòu)型的穩(wěn)定形成機(jī)制，我們采用分子動力學(xué)結(jié)合殘基點(diǎn)突變(甘氨酸替換)的方法研究Trp-cage中各個氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)在其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用，通過與野生天然態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征數(shù)據(jù)對比，確定了每個殘基側(cè)鏈在其整個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用。如殘基Tyr3與Pro19間的疏水作用、殘基Ser14和Arg16間的氫鍵作用以及Pro17所形成的三級天然接觸等穩(wěn)定作用對Trp-cage整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著特殊重要的作用。另外，具有相同側(cè)鏈的氨基酸殘基(Ser13和Ser14)由于其側(cè)鏈所處位置的不同導(dǎo)致其對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)程度也不同；鹽橋在模型多肽結(jié)構(gòu)中本身穩(wěn)定性非常高，不易被突變所破壞。這些結(jié)果為理解色氨酸籠折疊構(gòu)型的穩(wěn)定形成機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)2。