[科普中國]-活力檢查

發(fā)酵劑品質(zhì)鑒定

調(diào)制好的生產(chǎn)發(fā)酵劑在投產(chǎn)使用前需要進(jìn)行品質(zhì)鑒定，合乎要求才可使用。

感官檢查觀察發(fā)酵劑的質(zhì)地、組織狀態(tài)、凝固性狀與乳清析出情況，味道與色澤。品質(zhì)好的發(fā)酵劑應(yīng)乳凝固均勻、細(xì)膩和致密，無塊狀物，用手輕擊器壁時(shí)有一定彈性，沒有乳清析出或析出得少，具有誘人的芳香酸味，無異味，氣泡和色澤變化。品質(zhì)差的發(fā)酵劑出現(xiàn)乳凝固不結(jié)實(shí)，質(zhì)地不均勻致密，乳清析出過多。其原因是①乳中干物質(zhì)含量低(干物質(zhì)不能低于21%)；②培養(yǎng)溫度不適當(dāng)或培養(yǎng)時(shí)間過長；③雜菌污染。此外異味與氣泡的出現(xiàn)亦主要是污染雜菌的緣故。

細(xì)菌學(xué)檢查主要檢查發(fā)酵劑內(nèi)乳酸菌總菌數(shù)與雜菌污染。首先采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算總菌數(shù)，而后用乳清培養(yǎng)基以菌落計(jì)數(shù)法檢查活菌數(shù)。品質(zhì)好的發(fā)酵劑，活菌數(shù)不應(yīng)低于10^9個(gè)/mL。

化學(xué)檢查主要檢查酸度與揮發(fā)酸。含生香菌的發(fā)酵劑需檢查丁二酮。

活力檢查以乳酸菌產(chǎn)酸和抑菌能力確定發(fā)酵劑的活力1。

乳酸菌產(chǎn)酸能力產(chǎn)酸速率快的乳酸菌的篩選斜面保藏的乳酸菌活化后用0.85%無菌生理鹽水洗菌兩次，制備成菌懸液后按照2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中置于25℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，定期取樣測定pH值。以從商品泡菜湘飄飄爽口蘿卜頭中分離的乳酸菌中產(chǎn)酸最快的菌株CK1做為對(duì)照菌株。

高產(chǎn)酸量的乳酸菌的篩選將斜面保藏的乳酸菌活化兩次并擴(kuò)大培養(yǎng)后用0.85%無菌生理鹽水洗菌兩次制備成菌懸液，按照2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中置于25℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，發(fā)酵72h后取樣采用酸堿滴定法測定總酸含量。以從商品中分離的乳酸菌CK1做為對(duì)照菌株。

酸堿滴定法測定總酸量具體操作如下：

（1）氫氧化鈉（NaOH）標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配置：稱取110.00g氫氧化鈉，溶于100mL無CO2的蒸餾水(將蒸餾水超聲處理即為無CO2的蒸餾水)中，搖勻，密閉放置至溶液澄清。量取54mL澄清NaOH溶液用不含CO2的蒸餾水定容至1000mL，混勻，即配置成0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，備用；

（2）0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的標(biāo)定：稱取0.7500g烘至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，溶于50mL無CO2的蒸餾水中，用0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至粉紅色且30s不褪色。按下列公式計(jì)算：

C（NaOH）=m×1000/(V1-V2)M，

其中m—鄰苯二甲酸氫鉀的準(zhǔn)確數(shù)值（g）；V1—滴定用NaOH溶液的體積（mL）；V2—空白實(shí)驗(yàn)用NaOH溶液的體積（mL）；M—鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量（g/mol）[M(KHC8H4O4)=204.22]。

（4）產(chǎn)總酸量的測定：取發(fā)酵72h發(fā)酵上清液1mL，用無CO2的蒸餾水稀釋10倍，再滴加2滴酚酞指示劑，用標(biāo)定好的0.01mol/LNaOH滴定溶液滴定至粉紅色，且30s內(nèi)不褪色，記錄NaOH溶液消耗量，各做兩次平行。對(duì)照組為10mL無CO2的蒸餾水?？偹嵊?jì)算公式：

總酸（g/100mL）=[C2×(V3-V4)×K×F]×100/V，

其中C2—NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的準(zhǔn)確數(shù)值（mol/L）；V3—滴定用NaOH溶液的體積（mL）；V4—空白實(shí)驗(yàn)用NaOH溶液的體積（mL）；K—酸的換算系數(shù)，乳酸0.090；F—試液的稀釋倍數(shù)；V—試樣的體積（mL）。

乳酸菌抑菌能力抑制大腸桿菌能力較強(qiáng)的菌株的篩選（1）乳酸菌的活化：取斜面保藏的乳酸菌于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化兩次后，按照2%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h后離心（8000rpm，20min，4℃）取上清液，一部分用于測定其pH值，一部分過無菌0.22μm濾膜后保存于無菌容器中放置在4℃冰箱中用于抑菌試驗(yàn)。

（2）指示菌的制備：取斜面保藏大腸桿菌E.coli ATCC 8739接種于TSB培養(yǎng)基中，在37℃，160r/min的條件下活化兩次，然后按照2%的的接種量接入TSB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)6h，使菌液濃度達(dá)10^9cfu/mL。分別取原濃度菌液和稀釋至10^7cfu/mL的菌液取400μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上至無流動(dòng)的液體為止。

（3）發(fā)酵上清液（cell-free supernatant，CFS）抑菌試驗(yàn)：采用牛津杯法（劉冬梅等2006）研究CFS抑制E.coli ATCC 8739的能力。將E.coli ATCC 8739活化兩次后取400μL涂平板，在每個(gè)平板上均勻放置3個(gè)已經(jīng)經(jīng)滅菌的牛津杯，再向牛津杯中緩慢加入200μL無菌CFS，一半直接置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定抑菌圈的直徑，一半于4℃冰箱中擴(kuò)散24h后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測定抑菌圈的直徑d。根據(jù)抑菌圈的大小篩選抑制大腸桿菌E.coli ATCC 8739能力較強(qiáng)的乳酸菌。

抑制金黃色葡萄球菌能力較強(qiáng)的菌株的篩選（1）菌種的活化：取斜面保藏的乳酸菌于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化兩次后，按照2%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h后離心（8000rpm，20min，4℃）取上清液，一部分用于測定其pH值，一部分過無菌0.22μm濾膜后保存于無菌容器中放置在4℃冰箱中用于抑菌試驗(yàn)。

（2）指示菌的制備：取斜面保藏大腸桿菌金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213接種于TSB培養(yǎng)基中，在37℃，160r/min的條件下活化兩次，然后按照2%的的接種量接入TSB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)8h，使菌液濃度達(dá)10^9cfu/mL。分別取原濃度菌液和稀釋至10^7cfu/mL的菌液取400μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上至無流動(dòng)的液體為止。

（3）CFS抑菌試驗(yàn)：將S.aureus ATCC 29213活化兩次后取400μL涂平板，在每個(gè)平板上均勻放置3個(gè)已經(jīng)經(jīng)滅菌的牛津杯，再向牛津杯中緩慢加入200μLCFS，一半直接置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定抑菌圈的直徑，一半于4℃冰箱中擴(kuò)散24h后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測定抑菌圈的直徑d。根據(jù)抑菌圈的大小篩選抑制金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213能力較強(qiáng)的乳酸菌2。