大規(guī)模鑒定DNA表觀遺傳修飾轉(zhuǎn)錄因子閱讀器

　　8月6日，復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院研究員丁琛團(tuán)隊在Advanced Science發(fā)表最新研究成果。該團(tuán)隊聚焦轉(zhuǎn)錄因子研究十余年，在世界范圍內(nèi)首次實現(xiàn)大規(guī)模甲基化轉(zhuǎn)錄因子閱讀器的鑒定及功能研究。最新研究提供了最全面的轉(zhuǎn)錄因子—被修飾DNA相互作用組，涵蓋70%的轉(zhuǎn)錄因子。

　　值得一提的是，這些數(shù)據(jù)集將使該領(lǐng)域的其他研究人員能夠深入挖掘不同層次的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。此外，該數(shù)據(jù)集將增強(qiáng)對DNA甲基化修飾驅(qū)動的表觀遺傳學(xué)在與發(fā)育和疾病相關(guān)的關(guān)鍵生物過程中觸發(fā)的分子機(jī)制的理解。

　　復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院博士研究生白琳為論文第一作者，丁琛和中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所研究員楊雯雋為論文的通訊作者。

　　轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)豐度極低 

　　轉(zhuǎn)錄是將遺傳信息由DNA復(fù)制到RNA的過程，是蛋白質(zhì)生物合成的第一步，相當(dāng)于對DNA進(jìn)行“解碼”和“翻譯”的起始。轉(zhuǎn)錄因子（TF）是調(diào)控生物體轉(zhuǎn)錄過程的重要物質(zhì)。

　　轉(zhuǎn)錄因子在幾乎所有生物過程和基因表達(dá)模式中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。據(jù)統(tǒng)計，人類基因組中約有1500個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。轉(zhuǎn)錄因子可特異性識別下游靶基因，并隨后一起構(gòu)建出轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子與DNA的復(fù)合體，從而在調(diào)控各種生物過程的激活或者抑制中發(fā)揮重要作用。然而，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)豐度極低，使得對轉(zhuǎn)錄因子及其形成的復(fù)合物的純化及鑒定非常困難。

　　盡管 DNA 甲基化在各種生物過程和物種中都有過研究報道，但是對這些數(shù)據(jù)集的解釋往往不能提供對DNA甲基化水平動態(tài)變化的機(jī)制性理解。建立DNA甲基化和表觀遺傳領(lǐng)域的生理結(jié)果之間的因果關(guān)系是生命科學(xué)前沿領(lǐng)域的一個重要挑戰(zhàn)。

　　丁琛介紹，從以有的研究結(jié)果來看，要理解DNA甲基化機(jī)制的第一步，就要識別出將甲基化信號轉(zhuǎn)化為生物行為的DNA甲基化“閱讀器”和“寫入器”，即要確定與DNA甲基化動力學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)和DNA之間的相互作用，這對于破譯通過甲基化方式開展的各類生物過程中的遺傳“密碼”至關(guān)重要。

　　然而，另一個難題又來了?！耙驗檗D(zhuǎn)錄因子在生物體內(nèi)先天豐度的不足，迄今為止對于轉(zhuǎn)錄因子閱讀器的大規(guī)模研究仍無能為力?！?丁琛說。

　　拓展一項原創(chuàng)關(guān)鍵技術(shù) 

　　這一最新成果取得的基礎(chǔ)，是由丁琛團(tuán)隊自主開發(fā)并于2013年首次發(fā)布的一項原創(chuàng)關(guān)鍵技術(shù)——轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合元件序列（catTFRE）。該技術(shù)利用轉(zhuǎn)錄因子與序列特異性DNA元件結(jié)合的特點，首次設(shè)計合成串聯(lián)各種轉(zhuǎn)錄因子的多拷貝雙鏈DNA結(jié)合元件，并通過與預(yù)先制備好的核蛋白一起孵育，從而從核蛋白中分離純化具有DNA結(jié)合活性的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物。

　　“可以說，catTFRE是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的一項關(guān)鍵核心技術(shù)，對開展生物醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域的創(chuàng)新研究具有重大價值?！倍¤≌f。

　　然而，catTFRE這一技術(shù)是否可能拓展到表觀遺傳修飾的研究中，以及是否可以通過改良該技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的表觀遺傳修飾轉(zhuǎn)錄因子閱讀器的大規(guī)模篩選，仍未知。

　　經(jīng)過多年持續(xù)攻關(guān)，丁琛團(tuán)隊最終成功利用改良的modi-catTFRE技術(shù)進(jìn)行了大規(guī)模的內(nèi)源性甲基化、羥甲基化、甲?；D(zhuǎn)錄因子閱讀器的鑒定及功能研究，在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域取得了重要科研進(jìn)展。

　　在本次研究中，研究人員首先通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，以catTFRE為模版，以不同修飾的胞嘧啶堿基為原料分別獲得了5甲基胞嘧啶-TFRE序列（5mC-TFRE）、5羥甲基胞嘧啶-TFRE序列（5hmC-TFRE）和5甲?；奏?TFRE序列（5fC-TFRE），研究使用四種腫瘤細(xì)胞系和小鼠腦發(fā)育的五個時間點的核蛋白提取物，使用無標(biāo)記定量質(zhì)譜技術(shù)，共覆蓋到約70%的轉(zhuǎn)錄因子，提供全景式蛋白質(zhì)組學(xué)下的轉(zhuǎn)錄因子和被修飾DNA（TF-modified DNA）的結(jié)合模式。該研究同時還鑒定到多種特定修飾結(jié)合的轉(zhuǎn)錄共調(diào)解因子以及DNA結(jié)合蛋白等，并對5C、5mC、5hmC、5fC-modified特異偏好結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子閱讀器進(jìn)行了功能富集分析。結(jié)果顯示，無修飾5胞嘧啶DNA序列（5C-modified DAN）結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子主要執(zhí)行常規(guī)功能；5羥甲基胞嘧啶DNA序列和5甲?；奏NA序列（5hmC&5fC-modified DNA）結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子主要參與發(fā)育、分化等功能。

　　同時，該研究還全面解析24個轉(zhuǎn)錄因子家族和35個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域與甲基化修飾DNA結(jié)合的偏好性。其中，SCAN結(jié)構(gòu)域顯著偏好結(jié)合5甲?；奏NA序列（5fC-modified DNA），模擬蛋白結(jié)構(gòu)解析同樣證明該結(jié)論，進(jìn)一步證明表觀遺傳驅(qū)動的特征生物學(xué)過程。

　　除此之外，研究人員還對小鼠大腦發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄因子特異甲基化修飾DNA結(jié)合模式的動力學(xué)進(jìn)行了實證研究，揭示鼠腦發(fā)育過程的全景式轉(zhuǎn)錄因子—被修飾DNA結(jié)合模式，闡明不同轉(zhuǎn)錄因子修飾的DNA復(fù)合物在控制不同基因表達(dá)中的作用。轉(zhuǎn)錄因子—被修飾DNA相互作用組在不同發(fā)育階段具有不同的結(jié)合偏好性，進(jìn)一步證明大腦發(fā)育過程中動態(tài)表觀遺傳調(diào)控所起到的的關(guān)鍵作用。

　　相關(guān)論文信息：

　　https://doi.org/10.1002/advs.202101426