復旦腦科學研究院新成果：借鑒語義分割，開發(fā)空間轉(zhuǎn)錄組語義注釋工具 Pianno

自 2020 年被 Nature Methods 評選為年度技術(shù)以來，「空間轉(zhuǎn)錄組學」已成為當今生命科學領(lǐng)域最炙手可熱的革命性技術(shù)之一。簡單來說，該技術(shù)能夠獲取組織空間信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從時間和空間維度精準解析組織內(nèi)基因表達模式，以及細胞類群的空間位置關(guān)系等生物學特征，在疾病研究、生長發(fā)育、器官結(jié)構(gòu)和物種演化等領(lǐng)域的研究中均具有極高價值。

隨著空間轉(zhuǎn)錄組學在學術(shù)科研領(lǐng)域持續(xù)火爆，如 10x Visium、Slide-seq 以及 Stereo-seq 等空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)也如泉涌而出，這些最新成果和進展正徹底地改變?nèi)祟悓M織內(nèi)基因表達模式的研究。然而，僅僅獲得組織內(nèi)特定物理坐標的基因表達譜，還無法全面了解生物系統(tǒng)的復雜性，窮究其理，必須辨別組織內(nèi)每個空間點的生物學身份。

目前，基于機器學習的方法已被廣泛應用于識別空間點的群集，并使用標記基因解釋其生物學身份。但這些方法通常因為缺乏與群集內(nèi)已知結(jié)構(gòu)建立明確聯(lián)系的能力而受限。此外，手動注釋常被用作輔助識別已知結(jié)構(gòu)，但該方法常受限于研究人員的專業(yè)知識和主觀判斷，且無法應用于大規(guī)模分析當中。

針對上述挑戰(zhàn)，復旦大學腦科學研究院諸穎團隊近日在「Nature Communications」上發(fā)表了題為「Pianno: a probabilistic framework automating semantic annotation for spatial transcriptomics」的研究成果。研究團隊借鑒了計算機視覺中的「語義分割」思想，提出了「空間轉(zhuǎn)錄組語義注釋」概念，并開發(fā)了空間轉(zhuǎn)錄組語義注釋工具 Pianno，能夠為組織內(nèi)的空間點自動定義結(jié)構(gòu)或細胞類型，從而結(jié)合來自多個維度的信息，加強對復雜生物系統(tǒng)的解釋。

研究亮點：

Pianno 具有獨特的自動標記模式，適用于各種空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)生成的數(shù)據(jù)

與最先進的空間聚類方法相比，Pianno 展現(xiàn)出了卓越的性能，為空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)提供了新的視角

數(shù)據(jù)集：公開數(shù)據(jù)，嚴謹計算

該研究所用的數(shù)據(jù)集主要為公共數(shù)據(jù)集，來自不同的空間技術(shù)平臺，具體包括了人類背外側(cè)前額葉皮質(zhì)數(shù)據(jù)集 dlPFC、成年小鼠大腦半球冠狀切片數(shù)據(jù)集 Stereo-seq、小鼠海馬體預處理數(shù)據(jù)集 Slide-seqV2、人類胰腺導管腺癌數(shù)據(jù)集 ST、人類乳腺癌數(shù)據(jù)集 Visium、小鼠初級視覺皮層數(shù)據(jù)集 scRNA-seq、多個人類皮質(zhì)區(qū)域的 snRNA-seq 數(shù)據(jù)集、小鼠嗅球 (olfactory bulb) 的 DAPI 染色圖像等。

研究中，為避免降噪、平滑、銳化等圖像處理技術(shù)對生物原始特征造成破壞，研究團隊基于原始計數(shù)構(gòu)建了貝葉斯分類器 (Bayesian classifier) 以微調(diào)初始注釋。同時，研究團隊應用了高階馬爾科夫隨機場 (Markov random field, MRF) 先驗模型。在空間轉(zhuǎn)錄組學背景下，由于必須共同考慮每個位點的基因表達和空間位置，研究團隊還采用了空間泊松點過程 (spatial Poisson point process, sPPP) 模型。

Pianno：創(chuàng)新的自動化空間轉(zhuǎn)錄組語義注釋新工具
研究團隊提出了一個基于貝葉斯框架的新工具 Pianno，該工具結(jié)合了馬爾可夫隨機場 (MRF) 與空間泊松點過程 (sPPP)，充分利用了 sPPP 建模 RNA-seq 計數(shù)數(shù)據(jù)分布的能力，同時考慮了空間點的位置信息，可以使用預定義的標記基因列表，自動化地注釋空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中每個點的生物身份。

Pianno 框架

Pianno 輸入的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由空間坐標 (Spatial coordinates)、初始標記基因列表 (Initial marker list) 和原始基因計數(shù) (Spatial raw counts) 組成，每個模式至少提供一個已知的標記。

注釋過程由初始分割步驟 (initial segmentation step) 和精細化步驟 (refinement step) 構(gòu)成：

在初始分割步驟中，每個基因的空間表達被轉(zhuǎn)換為灰度圖像 (grayscale image)。對于每個目標模式 (pattern)，通過聚合與該模式相關(guān)的標記基因的灰度圖像來創(chuàng)建模式圖像 (pattern image)，然后確定每種模式的額外候選標記基因來更新初始標記列表 (Updated marker list)?？紤]到它們在最初注釋的結(jié)構(gòu)中的獨特表達模式，更新后的標記列表將會被整合到后續(xù)的精細化步驟中。

在精細化步驟中，構(gòu)建一個貝葉斯分類器 (Bayesian classifier) 來評估每個空間點屬于不同模式的后驗概率 (posterior probability)，然后根據(jù)后驗概率更新注釋。

Pianno 提供兩種更新注釋的方法：

對于語義標注中的連續(xù)模式，建議將概率分布作為模式圖像，返回給模式檢測器 (Pattern detector) 進行更新標注；

對于分散或尖銳的圖像模式，建議根據(jù)概率值直接更新標簽，因為它可以保留詳細信息。

總的來說，Pianno 簡化了注釋過程，同時采用啟發(fā)式方法 (heuristic approach) 使用初始單個標記基因來識別額外的標記基因，可以最大限度減少對已知標記數(shù)量的輸入。

研究結(jié)果：性能卓越、適用性強

在本次研究中，研究團隊對 Pianno 的性能、準確性、適應性等進行了驗證，并通過與現(xiàn)有方法進行比較，進一步論證了 Pianno 的能力。

在與基于聚類的工具在解剖結(jié)構(gòu)注釋的比較中，研究團隊使用 dlPFC 數(shù)據(jù)集中的 12 個樣本對 Pianno 的性能進行了評估，并與另一種基于標記但無空間信息的注釋方法 CellAssign 進行了比較。另外，評估過程中還考慮了無監(jiān)督聚類方法 Leiden 算法，以及 5 種空間聚類方法 (SpaGCN、SEDR、BayesSpace、DeepST 和 STAGATE)。

Pianno 在皮層結(jié)構(gòu)重建中的性能表現(xiàn)評估

評估發(fā)現(xiàn)，Pianno 的性能與經(jīng)驗豐富的研究員在基于形態(tài)特征和標記進行的手工注釋，達成了最高一致性，在 12 個樣本中，有 11 個樣本優(yōu)于其他測試方法。

多個指標評估結(jié)果

此外，研究團隊還通過其他分類指標，如準確率 (ACC)、宏平均精確度 (macro-averaging precision, P)、宏平均召回 (macro-averaging recall, R)、宏平均 F1 分數(shù) (F1) 和歸一化互信息 (normalized mutual information, NMI)，進一步全面評估了 Pianno 的優(yōu)越性能，如上圖 e 所示，Pianno 相關(guān)指標均位于較高水準。

Pianno在小鼠皮質(zhì)內(nèi)細胞類型注釋性能基準測試

隨后，研究團隊評估了 Pianno 預測細胞類型空間分布的能力。在本輪驗證中，研究團隊使用了成年小鼠半腦冠狀切片的 Stereo-seq 數(shù)據(jù)集，并將結(jié)果與通過不同策略推斷的細胞類型分布進行了比較，包括細胞分割后進行無監(jiān)督聚類，以及 3 種基于空間和單細胞轉(zhuǎn)錄組學整合的空間去卷積 (deconvolution) 工具。

研究發(fā)現(xiàn)，Pianno 對興奮性神經(jīng)元亞型分布的預測，顯示出與 Tangram 和 RCTD 相當?shù)哪Ｊ?，與它們在各層已知位置上表現(xiàn)出高度的一致性?？偟膩碇v，該結(jié)果證明了 Pianno 在預測空間數(shù)據(jù)集中復雜的細胞類型分布方面，具有很好的穩(wěn)健性和準確性，尤其是在無監(jiān)督方法遇到挑戰(zhàn)的情況下。

然后，研究團隊進一步評估了 Pianno 在不同平臺的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋各種形狀結(jié)構(gòu)的性能，并與 STAGATE 進行了比較。

Pianno 在不同平臺上注釋各種形狀結(jié)構(gòu)的性能表現(xiàn)

研究團隊使用 Pianno 對小鼠嗅球的 Stereo-seq 數(shù)據(jù)集中的解剖結(jié)構(gòu)進行了注釋，該數(shù)據(jù)集包含了 10,747 個空間點，涵蓋組織覆蓋區(qū)域和背景區(qū)域。

Pianno 能夠在幾分鐘內(nèi)同時完成背景去除和結(jié)構(gòu)標注。相比之下，當將聚類數(shù)設(shè)置為結(jié)構(gòu)數(shù)時，STAGATE 則無法識別出所有解剖結(jié)構(gòu)對應的聚類。

研究團隊還針對腫瘤微環(huán)境呈現(xiàn)出的高度異質(zhì)性，評估了 Pianno 在注釋復雜且分散結(jié)構(gòu)組織方面的表現(xiàn)。本輪測試分析了 2 個人類胰腺導管腺癌樣本和 2 個乳腺癌樣本的微環(huán)境。

腫瘤微環(huán)境注釋

總體而言，Pianno 表現(xiàn)出與專業(yè)病理學家手工標注一致的水平，證明了其在注釋不規(guī)則的復雜結(jié)構(gòu)時，特別是在異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境中，具有極大潛力。這對病理學家在理解腫瘤生物學的復雜性方面提供了寶貴的幫助，并有望為提供個性化治療策略找到新思路。

人工智能與復雜生物學結(jié)合大有可為
根據(jù)復旦大學腦科學研究院報道，目前該研究項目已得到國家重點研發(fā)計劃「生物與信息融合 (BT 與 IT 融合)」重點專項、科技創(chuàng)新 2030 —「腦科學與類腦研究」重大項目、國家自然科學基金、上海市科技重大專項和張江實驗室等基金的資助。

據(jù)了解，復旦大學腦科學研究院成立于 2006 年 4 月，是復旦大學全校性的神經(jīng)科學研究實體機構(gòu)、教育部「985 工程」二期重點建設(shè)的科技創(chuàng)新平臺之一，與醫(yī)學神經(jīng)生物學國家重點實驗室為「兩位一體」建設(shè)項目。

從建院至今，復旦大學腦科學研究院已經(jīng)結(jié)下累累碩果。該院多次面向國際和國家重大需求，承擔重大科研項目，產(chǎn)出重要研究成果。據(jù)其官網(wǎng)披露，該院研究人員已主持參與了一系列重大科研項目，包括科技部「973 計劃」、「863 計劃」、科技創(chuàng)新 2030 「腦科學與類腦研究」、國家重點研發(fā)計劃、國家科技重大專項「重大新藥創(chuàng)制」等等。

其實，除了復旦大學腦科學研究院外，目前已有不少實驗室、企業(yè)也開始關(guān)注到空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。

例如，中國科學院數(shù)學與系統(tǒng)科學研究院張世華團隊開發(fā)了 STA-系列工具。2022 年，該團隊發(fā)布了適應于不同空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、不同生物組織的生物組織空間亞結(jié)構(gòu)識別的人工智能工具 STAGATE。進入 2023 年后，該團隊又圍繞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)布了多項成果

針對來自不同技術(shù)、不同發(fā)育時間點、不同疾病條件的生物組織多切片空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建立了整合分析新工具 STAligner。

基于深度學習顯著圖的空間域特異可變基因識別方法 STAMarker，同時實現(xiàn)了空間域識別和對應的空間可變基因識別，有望為細粒度分析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供有效方法。

與中國科學院北京基因組研究所（國家生物信息中心）楊運桂、蔡軍團隊合作，繪制了地中海渦蟲再生過程中的三維空間轉(zhuǎn)錄組圖譜 STAPR，系統(tǒng)鑒定了多個再生關(guān)鍵調(diào)控因子。

ENGEP 增強空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)

華中師范大學數(shù)學與統(tǒng)計學學院張曉飛教授課題組開發(fā)了一款名為 ENGEP 的計算方法，利用 k近鄰加權(quán)回歸和集成學習策略，能夠準確預測空間轉(zhuǎn)錄組中未測基因的表達。此外，ENGEP 還能夠準確預測空間未測基因的表達模式，對增強空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)具有重要意義。

毫無疑問，AI 在空間轉(zhuǎn)錄學、乃至生物學領(lǐng)域的賦能不僅提高了研究效率，同時還為科研難點提供了新的解題思路。正如該論文在討論部分指出的 Pianno 所帶來的價值——可能取代現(xiàn)有勞動密集型的人工注釋，以自動化的方式提供高效、精準、低成本的形式為空間轉(zhuǎn)錄組學帶來變革，也將推動生物學新發(fā)展。

參考資料：
1. https://news.fudan.edu.cn/2024/0407/c2474a139894/page.htm

2. https://bfse.cas.cn/sxyqyjc/kyjz/202311/t20231110_4985132.html

3. https://kjc.ccnu.edu.cn/info/1009/3744.htm